美普他酚衍生物的AChE抑制剂和镇痛前药的设计、合成和生物活性

摘要

以进行性记忆减退和认知障碍为特征的阿尔茨海默病(Alzheimer′s Disease，AD)是严重威胁老年人生命健康的神经系统退行性疾病。目前临床使用的AD治疗药物主要是针对AD症状治疗的乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)抑制剂。新近研究发现AChE，尤其是其外周阴离子位点(peripheral anionic sites，PAS)，还参与加速Ap沉积的AD病理过程。同时作用于催化位点和PAS的AChE抑制剂，不仅能提高突触间ACh水平，减轻AD病人的症状；还能抑制AB沉积，干预AD的病理过程，产生疾病修饰作用。 美普他酚(meptazinol，MEP)是一个以外消旋体上市的作用于阿片受体的镇痛药，成瘾性低。其左旋体被发现具有中等强度的AChE抑制活性。本论文从(-)-美普他酚与 TcAChE 之间作用模式的研究出发，运用分子对接和基于药效团模型等计算机辅助药物设计手段，设计和合成了多个系列美普他酚和(-)-美普他酚衍生物、取代氨基甲酸酯类似物以及(-)-N-去甲基美普他酚双配基系列化合物。为改善美普他酚的口服生物利用度，我们合成一种酯酶敏感的香豆素类美普他酚酯前体药物，并建立苯甲酸类美普他酚酯前体药物的RP-HPLC含量测定方法。 1．(-)-美普他酚与TcAChE结合模式的分子对接研究通过比较两种常用分子对接方法FlexX和GOLD，我们建立一种可靠的、适用于AChE抑制剂结合模式研究的GOLD分子对接算法。GOLD算法比FlexX能更准确地预测晶体结构已知的复合物中配体的结合构象(RMSD<1.5 A)，而且打分函数评分的高低与活性值之间具有一定的相关性。 运用建立的GOLD方法比较(-)-和(+)-美普他酚分别在三种不同构象的TcAChE中的得分高低和作用力差异，阐明了(-)-和(+)-美普他酚与TcAChE的结合模式。(-)-美普他酚以一种开放式构象与AChE催化位点形成良好的疏水和氢键作用；而(+)-美普他酚可能因为缺乏一个关键的氢键作用而活性大大降低。这是国内外首次对美普他酚与AChE的作用模式进行探讨，研究结果为(-)-美普他酚衍生物的结构优化和AChE 抑制剂的设计提供了依据和参考。 2．美普他酚氮杂草环的结构改造和优化对先导化合物美普他酚的氮杂革环上1-N位和4-位进行结构改造。在(-)-美普他酚的1-N位上进行N-去甲基N-烷氧羰基取代；在美普他酚的4-位上引入羟基、氨基、胍基等极性基团；利用Beckmann重排反应制备含有八员环的新颖结构衍生物，考察不同位置引入氢键供体和受体对AChE抑制活性的影响。我们共合成中间体和目标化合物33个，其中目标化合物10个，中间体18个，意外产物5个。所合成化合物中25个为新化合物。对于Beckmann重排反应中发现的异常重排产物，进行了形成机理的深入探讨。初步药理结果显示，N-去甲基对活性影响不大，4-位碱性基团取代使活性增强，而 1-N 位烷氧酰基取代产物和Beckmann重排产物的活性均大大降低。上述结果表明1-N 位可质子化氮原子对活性非常重要，它能与AChE发生阳离子-π相互作用；八员环骨架可能因与AChE发生不利的立体碰撞而导致活性下降；4-位碱性基团的引入有利于活性的提高，可能也与阳离子-π相互作用有关，其中4-氨基美普他酚(23)和4-胍基美普他酚甲醚(25)的活性均强于美普他酚(1)。 3．(-)-N-去甲基美普他酚双配基的设计、合成、生物活性和分子模拟根据(-)-美普他酚与AChE的作用特点，设计与合成了11个以不同长度(n=2-12)链烃通过仲氮原子连接的(-)-N-去甲基美普他酚双配基(40 a-k)。体外AChE和BChE抑制活性试验结果显示，AChE抑制强度与连接链长密切相关，而连接链长对BChE抑制活性则影响不大。通过比较AChE和BChE的晶体结构，我们发现造成上述结果的原因在于，BChE活性位点多个芳香性氨基酸残基被脂肪族氨基酸取代，导致酶活性口袋扩大和PAS位点缺失。 活性最强的化合物(40h)对AChE(IC<,50>=3.9 nM)，的抑制活性，比单体药物(-)-美普他酚和上市药物利斯的明分别提高10,000倍和1400倍；对BChE(IC<,50>=10 nM)的抑制也相应有1500倍和150倍的提高。进一步的分子模拟研究揭示了(40h)与AChE和BChE的作用模式及其差别。(40h)能同时作用于AChE的催化位点和外周阴离子位点，与芳香性氨基酸残基Trp86和Trp286形成π-π疏水堆积作用和阳离子-π相互作用。而在BChE活性口袋中，(40h)以扭曲方式与脂肪族氨基酸残基作用。 在抗Aβ聚集试验中，(40h)能够有效的抑制AChE诱导的Aβ聚集，比对照药物碘化丙啶强两倍；同时在体内抗痴呆试验中，(40h)能够改善东莨菪碱引起的记忆缺损，比现有药物利斯的明强400倍。由此可见，(40h)是一个很有前途的候选药物，具有开发前景，有望成为具有疾病修饰作用的创新药物。 4．基于药效基团模型设计美普他酚氨基甲酸酯类衍生物用 Catalyst/HypoGen 方法，以毒扁豆碱和利斯的明等氨基甲酸酯类AChE抑制剂为训练集构建药效基团模型。所得模型包含四个重要化学特征：一个氢键受体、一个芳环平面，一个疏水中心和一个正电可离子化中心。经生物活性实验验证，该模型具有很好的活性预测能力。 以建立的药效基团模型对设计的美普他酚氨基甲酸酯类衍生物进行活性预测，挑选预测活性较好的化合物进行合成和药理筛选。所选化合物对AChE和BChE均有很强的抑制活性，超过现有药物利斯的明。活性最强的(-)-美普他酚二甲氨基甲酸酯(83)对AChE和BChE的抑制活性比利斯的明分别提高787倍和500倍。(-)-美普他酚苯氨基甲酸酯(84)尽管活性稍低，但胆碱能毒性也比(83)有所降低，安全性更好。(-)-美普他酚氨基甲酸酯类衍生物(83)和(84)是新型强效的AChE抑制剂，值得作为新药开发。进一步的体内抗痴呆试验正在进行中。 5．美普他酚前体药物的研究美普他酚与多数含酚羟基的药物类似，在肝脏中代谢，首过效应严重。口服生物利用度只有8.699％，临床应用受限。为防止体内代谢，我们利用一种酯酶敏感的基于香豆素的前药系统来掩蔽美普他酚的酚羟基，设计和合成前体药物美普他酚邻丙酰氧基-顺-苯丙烯酸酯(94)。药代动力学实验表明，该前体药物口服生物利用度比原药美普他酚提高 4 倍，首过效应明显降低。可作为 1-(3)类新药进行开发研究。 建立一种反相高效液相色谱(RP-HPLC)-紫外检测的分析方法测定美普他酚(2-氨基-6-甲基)-苯甲酸酯(97)盐酸盐的含量。此方法灵敏度和准确性高，可以用于含量测定和质量控制。 全文共合成中间体和目标化合物57个，其中目标化合物24个，中间体26个，意外产物7个。其中39个为未见报道的新化合物。运用分子对接方法，建立小分子抑制剂与AChE结合模式研究的评价体系，具有一定的可靠性和精确度。构建具有较好预测能力的氨基甲酸酯类AChE抑制剂的药效基团模型，可用于三维数据库搜索，发现新的先导化合物。发现2类具有开发前景的AChE抑制剂类AD候选药物。其中一类为(-)-N-去甲基美普他酚双配基(40h)，另一类为(-)-美普他酚二甲氨基甲酸酯(83)和苯氨基甲酸酯(84)。另外，发现一个能显著降低首过效应、提高口服生物利用度4倍的美普他酚前体药物(94)。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

前言

第一章阿尔茨海默病的发病机理和治疗进展

1.1 引言

1.2 AD的发病机理

1.2.1胆碱能假说

1.2.2 β淀粉肽假说

1.3 基于胆碱能假说的AChE抑制剂的研究

1.3.1 AChE的结构特征和活性位点

1.3.2 AChE与Aβ聚集

1.3.3 AChE抑制剂的经典结构类型

1.3.4 基于双位点的双分子AChE抑制剂的研究进展

1.4 基于β淀粉肽假说的Aβ治疗策略

1.4.1减少Aβ生成

1.4.2阻止Aβ聚集

1.4.3加速Aβ清除

1.4.4抑制tau蛋白异常磷酸化

1.5 结语和展望

参考文献

第二章美普他酚与AChE的分子对接研究

2.1 引言

2.2 分子对接方法

2.2.1 分子对接的基本原理

2.2.2 常用的分子对接软件

2.2.3 分子对接方法面临的问题与挑战

2.3 可逆性AChE抑制剂与TcAChE的作用模式

2.3.1已知药物在复合物晶体结构中的结合模式

2.3.2 AChE活性位点中Phe330的三种空间取向

2.4 FlexX和GOLD对AChE体系的分子对接的可靠性评价

2.4.1 评价方法

2.4.2 计算方法

2.4.3结果和讨论

2.4.4 小结

2.5 (-)-和(+)-美普他酚与TcAChE作用模式的分子对接研究

2.5.1 研究方法

2.5.2 计算方法

2.5.3结果和讨论

2.5.4 小结

2.6 本章小结

参考文献

第三章美普他酚氮杂(艹卓)环上取代衍生物的设计、合成和药理研究

3.1 引言

3.2 (-)-美普他酚N-去甲基-N-极性基团取代衍生物的合成

3.2.1 (-)-美普他酚的原料制备

3.2.2 (-)-N-去甲基美普他酚的合成

3.2.3 (-)-美普他酚N-去甲基-N-极性基团取代衍生物的合成

3.3 美普他酚4-极性基团取代衍生物的合成

3.3.1 关键中间体3-乙基二酮的原料合成

3.3.2 4-羟基、4-氨基和4-胍基美普他酚的合成

3.3.3 美普他酚扩环Beckmann重排衍生物的合成

3.4 药理结果

3.5 实验部分

3.6 本章小结

参考文献

第四章(-)-美普他酚双配基衍生物的设计、合成、药理和分子模拟研究

4.1 (-)-美普他酚双配基衍生物的设计

4.2 (-)-N-去甲基美普他酚双配基的活性预测

4.3 (-)-N-去甲基美普他酚双配基的合成

4.3.1 (-)-N-去甲基美普他酚双配基40(a-b，e-k)的合成

4.3.2 (-)-N-去甲基美普他酚双配基40(c-d)的合成

4.4 药理结果和讨论

4.4.1 体外AChE和BChE的抑制活性

4.4.2 AChE诱导的Aβ聚集的抑制活性

4.4.3体内抗痴呆活性

4.5 分子模拟研究

4.5.1 AChE和BChE的结构和功能比较

4.5.2 对接方法和打分函数的评价

4.5.3 双配基(40h)与mAChE和hBChE对接结果的构象比较

4.5.4 双配基(40h)与mAChE和hBChE的结合模式

4.6 实验部分

4.6.1 化学合成

4.6.2药理活性测试

4.6.3分子模拟方法

4.7 本章小结

参考文献

第五章基于药效基团模型的美普他酚氨基甲酸酯类衍生物的设计、合成和药理

5.1 引言

5.2 药效基团模型方法

5.2.1药效基团特征

5.2.2 药效基团模型的构建

5.2.3 药效基团模型构建常用软件

5.2.4 基于药效基团模型的数据库搜索

5.3 氨基甲酸酯类AChE抑制剂的药效基团模型构建

5.3.1 基于训练集分子建立和优化药效基团模型

5.3.2药效基团模型的评价

5.3.3 测试集分子的活性验证

5.4 美普他酚氨基甲酸酯类衍生物的设计、合成和药理

5.4.1 衍生物设计和基于药效基团模型的活性预测

5.4.2 化学合成

5.4.3 药理结果

5.5 实验部分

5.5.1 药效基团模型的构建

5.5.2 化学合成

5.5.3药理活性测试

5.6 本章小结

参考文献

第六章美普他酚前体药物的研究

6.1 引言

6.2 美普他酚邻丙酰氧基-顺-苯丙烯酸酯的设计、合成和生物利用度

6.2.1前体药物的合成

6.2.2 生物利用度测试结果

6.2.3 实验部分

6.3 盐酸美普他酚(2-氨基-6-甲基)-苯甲酸酯的含量测定

6.3.1仪器与试药

6.3.2方法与结果

6.3.3 讨论

6.4 本章小结

参考文献

附录一：化合物图谱（一）

附录一：化合物图谱（二）

附录二：在读期间发表的论文和专利

致谢