帕金森病的脑深部电刺激治疗与脑脊液蛋白变化的相关性研究

摘要

背景：帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是最常见的老年性神经疾病之一，其主要临床特征是静止性震颤、肌强直、运动减少和姿势平衡障碍等。PD的病因目前仍不十分清楚。研究认为PD黑质中多巴胺能神经元的变性坏死与蛋白的异常聚集有关。目前PD的诊断主要依据临床表现，尚无特异性的生物标志物用于诊断和鉴别诊断。因而，PD相关蛋白的研究是近几年的热点之一。但是，在CSF中研究PD相关蛋白的报道罕见，在国内尚未见相关报道。
　　 作为外科治疗手段之一的慢性脑深部电刺激(DBS)由于其安全、有效、可调和可逆等优点于1987年以来被广泛用于PD的临床治疗。但是其治疗的机制却不清楚。现在已经知道蛋白质在PD发病机制中起着重要的作用，而DBS应用后是否对脑脊液蛋白产生影响，目前国内外还没有文献报道。
　　 目的：本研究拟采用蛋白质组学技术对PD患者脑脊液中蛋白质进行研究，建立蛋白表达谱，了解PD相关蛋白的表达情况，找出PD与正常对照组存在的差异蛋白点以尽可能地发现关键性蛋白，以期对PD的发病机制及诊断提供可能线索和生物标志物；以及通过测定手术损伤后和DBS治疗后脑脊液中各种相关蛋白的变化，以探讨DBS治疗的作用机制；同时通过综合评价DBS治疗前后脑脊液各种相关蛋白的变化与统一帕金森病评定量表(unified Parkinson’s disease rating scale，UPDRS)中运动评分及日常生活能力(activities of daily living，ADL)评分之间的相关性，为DBS疗效的判定提供理论依据和可能的生物学检测指标。
　　 方法：本研究收集9例PD患者、8例正常对照者、5例DBS治疗者的脑脊液，采用荧光差异凝胶电泳(DIGE)技术分离并筛选PD和正常对照者以及DBS前后脑脊液中差异表达蛋白质，用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/MALDI-TOF-TOF)和电喷雾串联质谱(ESI-MS-MS)技术结合蛋白质数据库对这些差异蛋白质进行鉴定并分析。使用免疫印迹(Western-blot)技术对部分鉴定的蛋白质进行验证。分别在药物“开”和“关”的状态下，术前第一天和开机后第7天对5名DBS治疗者进行统一帕金森病评定量表(UPDRS)中的第Ⅱ部分日常生活能力和第Ⅲ部分运动能力进行评分，分别进行统计学处理同时计算其改善率。
　　 结果：5名DBS患者在手术中均出现“微毁损效应”，所有患者DBS后症状改善明显，无论在药物“开”还是“关”状态，其运动评分及日常生活能力评分均显著改善。DIGE方法显示匹配点相对比值选择为>1.5倍或<-1.5倍时，PD和正常对照间有20个明显的差异蛋白点，其中11个点在PD中上调，9个点下调；匹配点相对比值选择>1.2倍或<-1.2倍时，PD和正常对照间有48个明显差异蛋白点，其中19个蛋白点发生下调，29个蛋白点发生上调。MALDI-TOF/MALDI-TOF-TOF和ESI-MS-MS共鉴定出21个蛋白质，其中3个蛋白为白蛋白的异构体(片段?)，5个蛋白为免疫球蛋白的片断，2个蛋白为apoA-Ⅰ异构体，3个蛋白为未知蛋白，13个蛋白属于潜在的PD相关蛋白。其中蛋白MYPT1首次发现在CSF中表达。蛋白apoA-Ⅰ、MYPT1、tetranectin、C4A首次被发现与PD有潜在相关性。用Western-blot方法验证了apoA-Ⅰ、MYPT1、C4、IgA、tetranectin、EC-SOD等6个蛋白，发现MYPT1无法测出，其余5个蛋白用Western-blot方法在PD患者和正常对照者CSF中均测出有明确表达，而且在正常对照者和PD患者中的表达与DIGE方法所测均基本一致。但在DBS前后CSF中的表达与DIGE方法所测略有出入。
　　 结论：在13个属于PD潜在的相关蛋白中，部分蛋白有可能成为PD的生物标记物。而部分DBS前后改变明显的蛋白，有可能成为监测DBS疗效的生物学指标。DBS治疗的机制之一可能是通过与毁损不完全相同的机制维持或进一步促进微毁损的治疗效果。