抑制肥大细胞类胰蛋白酶表达对血管内皮细胞合成、分泌炎症介质的影响

摘要

动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病。在动脉粥样硬化病变过程中,单核细胞进入血管内膜分化为巨噬细胞并释放多种细胞因子,进一步趋化、聚集白细胞,并使白细胞迁移进入血管内膜,合成、释放大量细胞因子和炎症介质,损害血管.内皮细胞功能。在血管炎症发展过程中,肥大细胞从血管周围迁移进入内膜并被激活。活化的肥大细胞通过脱颗粒的方式释放多种分泌型介质,包括类胰蛋白酶、糜蛋白酶、组胺和肝素。类胰蛋白酶是一种具有多种生物学活性的天然蛋白酶。在心血管系统中,类胰蛋白酶激活平滑肌细胞、内皮细胞和心肌细胞上的PAR-2,引起血管舒张和收缩,细胞有丝分裂,细胞内钙离子浓度升高,von Willebrand因子释放以及一氧化氮释放等生物学效应。类胰蛋白酶与动脉粥样硬化的发生发展密切相关。类胰蛋白酶能够招募中性粒细胞,启动炎症反应；能够刺激内皮细胞合成IL-1β和IL-8,并促进IL-8的释放,通过IL-8的作用进一步促使白细胞聚集、浸润,参与血管炎症反应。
　　 血管内皮细胞功能的紊乱和失调是动脉粥样硬化血管炎性病变的早期病理改变。在这一过程中,单核.巨噬细胞、平滑肌细胞和内皮细胞合成并分泌多种炎症介质,破坏内皮细胞功能,增强内皮细胞层通透性,促进血管炎症发展。在这些炎症介质中,IL-6和TNF-α对促进动脉粥样硬化血管炎性病变的形成和发展起了非常重要的介导作用。IL-6通过刺激肝脏,诱导C反应蛋白大量生成,参与动脉粥样硬化的早期炎症反应。TNF-α是炎症反应中最重要的启动因子之一,通过激活NF-κB,促进多种炎症介质释放,使炎症反应产生级联效应,介导血管炎症的发展。研究证实,类胰蛋白酶通过激活细胞膜上的PAR-2促进单核细胞合成并分泌IL-6、TNF-α和IL-1β,从而影响动脉粥样硬化的血管炎性病变过程。本实验室证实,类胰蛋白酶通过激活PAR-2上调血管内皮细胞IL-6和TNF-α的mRNA表达及蛋白分泌,并呈时间依赖性和浓度依赖性。
　　 本实验中,运用RNA干扰的方法,根据类胰蛋白酶序列设计siRNA片段,将siRNA-载体转染肥大细胞P815,通过RT-PCR检测P815细胞中类胰蛋白酶的mRNA表达。结果显示,RNA干扰能够明显抑制P815细胞表达类胰蛋白酶。在建立P815细胞类胰蛋白酶表达抑制模型的基础上,制作、收集类胰蛋白酶正常表达(P815条件培养液)和类胰蛋白酶表达抑制(siRNA-P815条件培养液)两种不同的条件培养液,并通过ELISA检测不同条件培养液中类胰蛋白酶的含量。结果显示,siRNA-P815条件培养液中类胰蛋白酶含量明显低于P815条件培养液。用不同条件培养液培养bEnd.3细胞后,分别通过RT-PCR和ELISA检测bEnd.3细胞IL-6和TNF-α的mRNA表达及蛋白分泌。结果显示,用siRNA-P815条件培养液培养的bEnd.3细胞,其IL-6和TNF-α的mRNA表达水平及蛋白分泌水平明显低于用P815条件培养液培养的细胞,而略高于用DMEM培养液培养的细胞。实验证明,肥大细胞类胰蛋白酶能够促进血管内皮细胞合成并分泌IL-6和TNF-α;抑制类肥大细胞胰蛋白酶表达能够明显下调血管内皮细胞合成并分泌IL-6和TNF-α。
　　 肥大细胞类胰蛋白酶在心血管疾病特别是动脉粥样硬化中的作用正受到越来越多的关注。本实验证实,类胰蛋白酶能够影响血管内皮细胞对重要炎症介质IL-6和TNF-α的表达,从而参与动脉粥样硬化的血管炎症病变过程。本实验运用RNA干扰的方法降低类胰蛋白酶表达,从而抑制动脉粥样硬化相关炎症介质的产生,为动脉粥样硬化的治疗提供了新的靶点。