川崎病急性期中性粒细胞功能及S100蛋白表达的变化

摘要

目的:川崎病是一种儿童常见的急性血管炎综合征,主要侵害中小动脉尤其是冠状动脉。目前川崎病的病因和发病机制均不清楚,有研究显示外周血中性粒细胞在川崎病病程中起重要作用。但中性粒细胞在川崎病中的作用并不清楚,现有的研究结果也存在争议。S100A8和S100A9是S100钙结合蛋白质家族成员,主要由血液中活化的中性粒细胞和单核细胞分泌,在急性炎症中起重要作用。本研究拟观察川崎病急性期中性粒细胞功能及S100A8、S100A9蛋白表达的变化,并探讨其意义。
　　 方法:川崎病组选取2006年11月～2007年7月复旦大学附属儿科医院住院川崎病患儿,共34人,均符合2002年日本川崎病诊断标准,并选取同时期年龄匹配的手术患儿作为对照。血标本的采取时间在川崎病确诊之后使用IVIG之前,以及使用IVIG后七天左右。中性粒细胞DHR分析是根据Roesler等提出的DHR荧光染色方法建立的中性粒细胞活性检测方法。临床留取2小时内的200μl肝素抗凝静脉血,分别吸取50μl使用磷酸缓冲液(PBS)、趋化肽N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰苯丙氨酸(fMLP)和佛波脂(PMA)刺激孵育,溶血去除红细胞后,在流式细胞仪(FCM)上观察中性粒细胞活化指标:活化百分比(Gate,％)。中性粒细胞中S100A8、S100A9mRNA检测方法:从2ml静脉血中分离中性粒细胞用Trizol reagent保存,从中提取总RNA后用分光光度计260nm和280nm比值定量,使用荧光定量PCR检测定量。
　　 结果:1、经PBS、fMLP作用的川崎病急性期患儿的中性粒细胞活化百分比,在IVIG前分别为36.7±26.9和71.1±26.0,和对照组比较明显升高(P值分别为0.033和0.000)。IVIG使用之后,6例自身对照的病例的中性粒细胞活化百分比下降(PBS:从33.5±21.4降到16.0±11.7,P=0.109;fMLP:从78.4±15.9降到30.1±21.1,P=0.001),达到对照组水平(PBS:P=0.149;fMLP:P=0.867)。
　　 2、PMA作用的中性粒细胞,川崎病患者及对照组的活化百分比均在90％以上,排除研究对象有中性粒细胞活化先天异常。
　　 3、川崎病急性期患者中性粒细胞中S100A8、S100A9mRNA表达在使用IVIG前分别为6.70±0.66和6.65±0.57,对照组为2.55±0.52和3.60±0.7,前者较后者明显升高(P均为0.000)。
　　 4、无冠状动脉损害患儿在使用IVIG前中性粒细胞中S100A8、S100A9mRNA表达分别为6.92±0.59和6.80±0.51,IVIG后分别为6.16±0.81和6.00±0.77,均较IVIG前明显降低(P分别为0.001和0.000),但仍明显高于对照组。
　　 5、冠状动脉损害患儿在使用IVIG前中性粒细胞中S100A8、S100A9mRNA表达分别为5.97±0.32和6.14±0.45,IVIG后分别为6.66±0.63和6.58±0.45,均较前升高(P分别为0.038和0.12),S100A9mRNA升高无统计学意义。
　　 6、IVIG治疗后,IVIG无效的患者中性粒细胞中S100A8、S100A9 mRNA较使用之前升高。
　　 结论:1、川崎病患者的中性粒细胞活化百分比在使用IVIG前明显高于对照组,说明在川崎病急性期不仅有中性粒细胞数量增加,也有其功能的活化。中性粒细胞活化百分比在使用IVIG后明显下降,达到正常水平,同时临床症状改善,提示IVIG抑制了中性粒细胞作用,其可能是IVIG对川崎病有效的一个作用点。
　　 2、川崎病急性期中性粒细胞S100A8、S100h9 mRNA在使用IVIG前均明显高于对照组,提示中性粒细胞S100A8、S100A9可能参与了川崎病的发病机制。使用IVIG后,无冠状动脉损害患儿S100A8、S100A9 mRNA均明显降低,同时临床症状改善,提示中性粒细胞可能是IVIG对川崎病有效的一个作用点。而冠状动脉损害和IVIG无效患者的S100A8、S100A9 mRNA升高,说明中性粒细胞的持续活化,提示中性粒细胞参与了患者冠状动脉的损害。