Hsp70在缺糖损伤的HeLa细胞中对Bax与Bcl-2表达及Bax构象改变的影响

摘要

缺血性疾病常常对人体造成不可逆的损伤,其发生机制也日益受到人们的关注。葡萄糖的匮乏是缺血损伤的主要致病因素,由于葡萄糖的摄取是细胞内能量代谢的中心环节,所以缺糖损伤的直接严重后果就是细胞死亡,这一论点已经得到了充分的证实。近年的研究还表明缺糖损伤还会导致细胞内许多凋亡因子的产生,在众多凋亡通道上左右着凋亡的进程。因此了解细胞在缺糖损伤过程中细胞水平,亚细胞水平及分子水平的变化对于缺糖损伤致病机制的阐明有重要的意义。
　　 人类宫颈癌HeLa细胞是分子生物实验常用的细胞模型。以往很多研究表明,热激蛋白Hsp70在很多应激情况下可以抑制细胞的凋亡,所以本文中主要检测缺糖引起的HeLa细胞损伤情况以及Hsp70对其的影响。本文用获赠的人类正义Hsp70重组质粒[pcDNA3.1(+)-Hsp70]转染正常HeLa细胞,用G418筛选并经Western Blot法鉴定获得了Hsp70过表达HeLa细胞。用无糖培养建立缺糖损伤细胞模型；用MTT法测细胞活率；用Hoechst染色法和Giemsa染色法从形态上观察并计算细胞凋亡率。结果表明,在缺糖48h内,Hsp70明显抑制了缺糖诱导的HeLa细胞凋亡并增强其活力。
　　 以往研究证实,在细胞凋亡过程中,Hsp70主要通过与其它蛋白的相互作用来调控凋亡,包括Bcl-2家族。Bcl-2家族蛋白是在细胞凋亡过程中起关键性作用的一类蛋白质,在细胞发生凋亡时,Bcl-2家族中的促凋亡蛋白成员能够发生活化,移位到线粒体的外膜上,进而引起其他促凋亡因子的释放,导致细胞凋亡,但同时此现象能够被该家族的抗凋亡蛋白阻止,所以Bcl-2家族成员的构成比例是凋亡调控的重要因素,尤其Bax/Bcl-2比值是启动细胞凋亡的关键所在。
　　 为了进一步探讨Hsp70抑制缺糖凋亡的机制,本文用RT-PCR法和Western-Blot法分别在mRNA和蛋白水平测Bax和Bel-2的表达,并计算Bax/Bcl-2比值；用细胞免疫化学法和荧光免疫法测Bax构象改变情况。结果表明,HeLa细胞在缺糖48h内,Hsp70能够抑制细胞中Bax/Bcl-2的增高以及Bax构象的改变。根据以上结果我们初步推断,在缺糖诱导的HeLa细胞中,Hsp70能够通过与Bcl-2家族成员作用而抑制凋亡的发生。
　　 本研究采用Hsp70正常表达和过表达的两组细胞,拟通过建立缺糖应激损伤的模型,检测并比较两组模型在细胞水平及分子水平的损伤指标和相关凋亡因子的表达水平,来研究Hsp70对凋亡的影响及其可能机制。旨在为一些重要的应激蛋白在能量代谢损伤过程中的作用位点,作用对象及作用方式的研究提供一个适宜的研究平台,从而为相关蛋白的功能研究奠定一定基础。