甜味蛋白Brazzein在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的表达研究

摘要

甜味蛋白是一类具有高甜度、低热量的天然甜味剂。已知的七种甜味蛋白分别是Brazzein,Curculin,Mabinlin,Miraeulin,Monellin,Pentadin和Thaumatin.其中,植物甜蛋白Brazzein是1994年由D.Ming等首先在野生非洲植物Pentadiplandrabrazzeana Baillon的果实中分离得到。Brazzein是由54个氨基酸残基组成的蛋白分子,含四个分子内二硫键,分子量约6.5k Da,三维分子结构已经获得解析。它的甜度是相同重量蔗糖的2000倍,且耐高pH,热稳定性好,80℃加热4 h不破坏,98℃2h不失去甜味。与蔗糖不同,Brazzein的吸收不依赖于胰岛素。可以取代传统的小分子糖类作为食品添加剂生产更加健康和自然的产品。然而由于直接从植物中提取甜味蛋白产量少成本高,近十几年来人们一直在积极探索利用基因工程技术大量表达这些蛋白。目前报道虽实现了Brazzein在E.coli中的表达,但是蛋白的可溶性表达的量很低导致没有活性。在现今已有的研究基础上,本课题在两个原核表达系统中实现了Brazzein的活性表达。主要研究内容包括：
　　 ⑴依照Escherichia Coli的偏爱密码子,人工合成了编码Brazzein的cDNA用于在E.coli表达系统中研究Brazzein的活性表达情况。对比是否与大肠杆菌信号肽融合表达的结果,证实无信号肽序列的brazzein基因在大肠杆菌中实现了可溶性活性表达。还研究了其与GST蛋白的融合表达以及利用Xa因子酶切获得无tag的Brazzein目的蛋白。另外还研究了在Brazzein肽链的N端引入(Gly)5柔性短肽并与6His-tag融和,便于必要时的纯化,研究证实这种融合形式对Brazzein蛋白活性产生了影响,实验中未能检测到甜味活性,这也与以往的研究结果相同,在N端引入的序列会导致Brazzein失去活性。
　　 ⑵将其表达于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis中.这是基于枯草杆菌是革兰氏阳性菌,不含内毒素等热源,可以作为安全的表达系统,而且它生长快,仅需要相对简单的培养条件,另外它的细胞能够为目的蛋白的表达提供还原性环境,有利于二硫键的形成使Brazzein肽链能够正确折叠。此外,它还能有效的分泌表达外源蛋白至细胞外培养基中。
　　 ⑶依照枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的偏爱密码子,合成适于在Bacillussubtilis中表达的Brazzein编码序列。将其与Bacillus subalis BF7658菌株的淀粉水解酶基因amyE的强信号肽序列拼接进行融和表达,探讨实现Brazzein向细胞外培养基分泌表达的可行性。但实验未能得到Brazzein的分泌表达。另外,我们在Brazzein编码序列中引入肽链31His→Ala的突变,合成了brazzein定点突变基因,将其在枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600中实现了可溶性表达,并检测到蛋白产物的甜味活性。这是基于有报道称这个31His→Ala的突变体具有相当于野生型两倍的甜味活性。本课题使用的枯草芽孢杆菌WB600是一株6种蛋白酶基因都发生突变的菌株[6],将它作为基因工程宿主菌,应用PUB110的衍生质粒pMA5,组成型的表达目的蛋白Brazzein,并得到了表达量较高的活性蛋白产物。