植物核小体组装蛋白1(NAP1)家族成员的功能鉴定

摘要

真核生物基因组以高度折叠的染色质(Chromatin)形式贮存于细胞核内。染色质的基本结构和功能单位是核小体(Nucleosome)，其核心部分由大约146-147bp的DNA围绕着由各两个分子的H2A，H2B，H3和H4构成的组蛋白八聚体组成。核小体的正确组装对于重建有功能的染色质结构十分重要，影响着包括DNA复制，修复，重组，转录，细胞增殖与分化以及个体发育等诸多生物过程。核小体组装需要组蛋白分子伴侣的参与，组蛋白分子伴侣不仅影响着染色质的结构形成及动态调节，而且参与到组蛋白的储存，核质运输以及组蛋白在染色质组装过程中的掺入和替换。
　　 NAP1(Nucleosome Assembly Protein1)是目前被确认的在各物种(酵母，动物和植物)中都保守存在的组蛋白H2A-H2B分子伴侣。通过去除/替换染色质上的组蛋白H2A/H2B，或者通过调节核小体的滑动，NAP1可以改变染色质的结构及调节染色质的代谢，进而影响细胞分化和个体发育等过程。果蝇和老鼠中的遗传学研究结果表明一个NAP1同源基因的缺失会导致胚胎致死，说明了NAP1蛋白在胚胎发育中的重要功能。NAP1蛋白在植物中也是高度保守的，而目前有关植物NAP1蛋白的结构和功能研究还处于起步阶段。我的博士论文主要利用分子生物学、生物化学、细胞生物学以及遗传学等研究手段分析了高等植物NAP1家族成员的功能及其对植物生长发育的影响。
　　 我博士论文的第一部分工作主要对水稻和烟草NAP1家族成员进行了分子和生化分析。我们实验室利用筛选cDNA文库的方法，分离到3个水稻NAP1基因和4个烟草NAPI基因(Dong et al.，2003.Planta216，561-570)。我们证明了烟草NAP1蛋白可以结合组蛋白H2A-H2B，我们的结果支持了NAP1作为H2A-H2B分子伴侣的模式在植物中也是保守的。对NAP1的结合蛋白的分析表明烟草NAP1蛋白可以和微管蛋白及有丝分裂细胞周期蛋白Nicta；CYCB1；1结合，暗示其在微管动力学调控上的潜在功能。利用绿色荧光蛋白作为标记，我进一步研究了水稻和烟草NAP1家族成员的亚细胞定位。核定位输出抑制剂LMB处理以及核定位输出信号突变实验表明Orysa；NAP1；1和Nicta；NAP1；1可以在细胞质和细胞核中穿梭。比较有趣的是，其它三个烟草NAP1蛋白以及Orysa；NAP1；2只定位于细胞质中，而且并不具有核、质穿梭能力。此外，Orysa；NAP1；3缺少典型的核定位信号，但却在细胞核和细胞质中均有分布。我们还发现只有Orysa；NAP1；3可以在体外被酪蛋白激酶2(CK2，Casein kinase2)磷酸化。然而，通过点突变分析，我们却发现Orysa；NAP1；3的磷酸化并不影响该蛋白的亚细胞定位。以上结果已发表于Plant Physiology杂志。
　　 由于拟南芥作为模式植物在遗传分析上具有巨大的优势，我们转而利用拟南芥系统对NAP1家族蛋白进行功能研究。拟南芥编码4个NAP1基因，我们发现其中一个基因(AtNAP1；4)特异表达于雄蕊以及根延长区的部分，而其它三个NAP1基因则全局表达。更进一步，我们发现拟南芥NAP1蛋白可以形成同源和异源二聚体，同时他们也可以结合植物的组蛋白H2A和H2B。在我们实验室的标准生长条件下，三个全局表达的NAP1基因的缺失的两个三突变(Atnap1；1-1Atnap1；2-1Atnap1；3-1和Atnap1；1-1Atnap1；2-1Atnap1；3-2)未表现出任何明显表型。而通过各种DNA损伤试剂的处理，我们发现这两个三突变表现出中等强度的紫外(UV-C)敏感以及体外修复DNA损伤的能力降低。两个三突变的转录谱和染色质免疫共沉淀分析表明拟南芥NAP1蛋白可以直接结合到一些核苷酸剪切修复(NEK，Nucleotide excision repair)途径基因的启动子上，并调节这些基因的表达。这些结果提示拟南芥NAP1家族成员蛋白保守地行使组蛋白H2A/H2B分子伴侣的功能，并且参与调节核苷酸剪切修复途径。
　　 有趣的是，三突变的转录谱还表明，除了核苷酸剪切修复途径基因外，某些激素和压力应答相关基因的表达也发生了改变，提示我们去研究NAP1蛋白在植物对激素和压力应答方面的功能。我们发现三突变Atnap1；1-1Atnap1；2-1Atnap1；3-1表现出对脱落酸(ABA，Abscisic acid)的轻微超敏感。相反，Atnap1；1-1Atnap1；2-1Atnap1；3-2则在苗的生长和气孔活动方面比较强烈地表现出对脱落酸的不敏感，并导致该三突变植株盐耐受性的降低。此外，所有含有Atnapl；3-2等位的突变体以及Atnap1；3-2杂合子都表现对脱落酸的脱敏性。更细致的研究表明在所有含有Atnap1；3-2等位的突变体以及Atnap1；3-2杂合子中均存在一个AtNAP1；3的截短蛋白(碳末端34个氨基酸缺失，命名为AtNAP1；3T)。过量表达这个截短蛋白导致植物对脱落酸的脱敏，并导致一些ABA信号转导途径基因的表达降低，证实该AtNAP1；3T可能通过调节这些基因的表达显性影响拟南芥对脱落酸的反应。
　　 综上所述，我的博士论文工作比较深入地阐述了植物NAP1家族成员的分子、细胞和生物学功能，表明植物NAP1蛋白参与基因表达调控以及对非生物逆境的反应。