神经干细胞移植延缓失神经肌萎过程中突触形成及其功能的实验研究

摘要

第一部分，神经干细胞体外培养扩增,体内移植后延缓失神经肌萎的作用
　　目的：验证胚胎脊髓神经干细胞的提取、体外培养和增殖方法,研究神经干细胞移植到损伤的外周神经后,延缓失神经肌萎的效果。
　　方法：取孕10—12天的SD大鼠,通过机械吹打法提取脊髓神经干细胞、以无血清限定性培养基进行培养,扩增及纯化得到大量增生的神经干细胞,以神经干细胞特异性抗体Nestin进行鉴定,将神经干细胞进行体外分化,通过特异性抗体染色检验其分化为神经终末细胞的能力。传2—3代后,将扩增的神经干细胞球分散成单细胞悬液并调整密度为10 6/ul,备用。制作胫神经切断,小腿三头肌失神经支配模型,以微量注射器移植10 6/ul×5ul干细胞悬液至切断的胫神经远端;设立对照组,仅移植5ul神经干细胞培养液,每组各24只。分别于术后3月,5月和7月取材,每次8只,分别观察移植神经干细胞在体内存活及分化成为神经元的情况;测量三头肌湿重及肌纤维横截面积维持率,验证神经干细胞移植能否延缓失神经支配骨骼肌的萎缩及其程度。
　　结果：利用机械吹打和无血清限定性培养基可以得到大量的脊髓神经干细胞,得到的神经干细胞可以在体外大量扩增并分化为多种神经终末细胞,证明取得的神经干细胞活性良好;神经干细胞移植后3、5、7月取材及免疫组化染色显示,移植段胫神经内有大量存活的神经干细胞及其分化而来的神经元,神经元可以合成大量的突触素,随着时间延长,分化而来的神经元明显增加;随着时间延长,移植和对照组三头肌湿重,肌纤维横截面积均进行性下降,但对照组下降更明显(P〈0.05)。
　　结论：1、机械吹打及无血清限定性培养基适用于脊髓神经干细胞的提取及培养;2、神经干细胞在损伤的外周神经系统中可以长期存活并分化为神经元;3、神经干细胞移植到外周神经系统内可以延缓失神经肌萎的程度。
　　第二部分，移植神经干细胞与靶肌肉形成新突触过程的实验研究
　　目的：将体外培养、扩增得到的神经干细胞移植到胫神经切断模型中,观察神经干细胞能否与失神经支配三头肌重新形成突触,以及新形成突触的功能。
　　方法：采用机械吹打和无血清限定性培养基得到大量活性良好的神经干细胞,建立三头肌失神经支配模型,按第一部分方法分成移植组和对照组,每组30只。于移植术后3,5,7月进行检测,通过三头肌内突触(神经肌肉接头)免疫组化染色,神经电生理传导,示踪剂顺向和逆向传导实验,比较神经干细胞移植后对突触后膜的影响,研究神经干细胞能否与靶肌肉形成新的突触,以及新形成的突触是否具有电传导和物质传递功能。
　　结果：3月时:移植组中突触前膜消失,突触后膜萎缩退变,未能检测到电传导,对照组中,突触前膜消失,突触后膜萎缩退变更加明显,同时数量减少,无电传导能力;5月时:移植组中检测到少量不完整的新生突触前膜,突触后膜趋向正常,能检测到电传导,对照组中突触前膜消失,后膜碎裂明显,无电传导能力;7月时:移植组中发现形态上呈各个发育阶段突触前膜,但数量少于突触后膜,而突触后膜形态基本正常,能检测到明显的电传导现象,同时顺向和逆向示踪均为阳性结果,对照组中,突触前后膜均完全消失,电生理检测和顺向逆向示踪均为阴性结果。
　　结论:1、神经干细胞移植到损伤的外周神经后,可以延缓突触后膜萎缩退变和数量减少的发生;2、移植神经干细胞能够与失神经支配靶肌肉形成新的突触联系;3、新形成的突触具有物质传递和电传导功能。
　　第三部分,宿主再生神经轴突与移植神经干细胞形成突触的实验研究
　　目的:研究神经干细胞移植到外周神经系统后,宿主再生神经轴突与移植神经干细胞及其分化而来细胞之间的关系。
　　方法:取孕10—12天F344大鼠,提取、培养并纯化脊髓神经干细胞;移植3cm长的F344神经干至GFP转基因大鼠的远端胫神经,同时移植10 6/ul×5ulF344神经干细胞悬液至移植段F344神经干中;2周后吻合宿主胫神经近端及移植段F344神经.术后2周取材,并进行免疫荧光染色和共聚焦观察,研究宿主再生神经轴突能否与移植并分化而来的神经元形成突触联系。
　　结果:在干细胞移植后4周(神经吻合后2周),神经干细胞可存活并分化为神经元;近端再生的神经轴突能与移植并分化而来的神经元形成突触联系。
　　结论:宿主再生神经轴突能与移植分化而来的神经元形成突触联系。

目录

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分 神经干细胞体外培养扩增,体内移植后延缓失神经肌萎的作用

实验一 大鼠胚胎脊髓神经干细胞的提取、体外培养及分化

实验二 神经干细胞体内移植、存活、分化及延缓失神经肌萎的作用

第二部分 神经干细胞移植后与靶肌肉形成新突触过程的实验研究

实验一 移植神经干细胞与失神经支配靶肌肉形成突触的形态学研究

实验二 移植神经干细胞与失神经支配靶肌肉形成突触的功能学检测

第三部分 宿主再生神经轴突与移植神经干细胞形成突触的实验研究

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

全文小结

主要创新点

综述

附录

致谢