细胞周期蛋白Hcdc14A在高糖和高游离脂肪酸及低氧联合刺激诱导脑血管内皮细胞损伤中的调控机制研究

摘要

第一部分高糖、高游离脂肪酸和低氧刺激对Hcdc14A和相关周期蛋白表达及细胞增殖和凋亡的影响
　　目的:观察高糖、高游离脂肪酸(FFA)和低氧刺激对人脑血管内皮细胞Hcdc14A和相关周期蛋白表达及细胞增殖和凋亡的影响。
　　方法:分别采用不同条件的高糖、高FFA和低氧刺激人脑血管内皮细胞:RT-PCR和Western-blot检测Hcdc14A的mRNA和蛋白表达;Western-blot检测相关周期蛋白cyclinB、cyclinD、cyclinE和P53蛋白表达;XTT法和CCK8法测定细胞增殖率和存活率;流式细胞术和caspase3活性检测法观察细胞凋亡;流式细胞术观察细胞周期;荧光探针观察细胞骨架蛋白F-actin空间结构;电镜观察细胞超微结构。
　　结果:1.高糖、高FFA和低氧刺激均可明显下调人脑血管内皮细胞Hcdc14A的mRNA和蛋白表达。
　　2.高糖、高FFA和低氧刺激均可下调cyclinB、cyclinD和cyclinE蛋白表达,上调P53蛋白表达。
　　3.高糖、高FFA和低氧刺激均使细胞增殖率和存活率下降。
　　4.高糖、高FFA和低氧刺激均使细胞凋亡率增加,Caspase-3活性增强。
　　5.高糖、高FFA和低氧刺激均明显下调细胞周期中S期和G2-M比例。
　　6.高糖、高FFA和低氧刺激均对细胞骨架蛋白F-actin空间结构产生一定影响。
　　7.电镜观察发现高糖、高FFA和低氧刺激后凋亡细胞增多,联合刺激组凋亡小体形成较明显。
　　结论:高糖、高FFA和低氧刺激均可明显下调人脑血管内皮细胞Hcdc14A和相关周期蛋白表达,阻滞细胞周期,降低细胞增殖率,诱导细胞凋亡,并对细胞骨架蛋白F-actin空间结构和细胞超微结构产生一定影响,三者联合刺激上述作用最为明显。
　　第二部分过表达Hcdc14A对相关周期蛋白表达及细胞增殖和凋亡的影响
　　目的:观察过表达Hcdc14A对相关周期蛋白表达及细胞增殖和凋亡的影响。
　　方法:构建Hcdc14A真核表达载体并转染HEK293细胞和Hela细胞;共聚焦显微镜观察Hcdc14A在细胞分裂期的定位;Western-blot检测重组质粒转染后Hcdc14A表达效率及其过表达对cyclinB、cyclinD、cyclinE和P53蛋白表达的影响;CCK8方法检测重组质粒转染并给予高糖、高FFA和低氧联合刺激后的细胞存活率;流式细胞术和caspase3活性测定法观察转染和联合刺激后的细胞凋亡;流式细胞术观察转染和联合刺激后的细胞周期;荧光探针观察转染和联合刺激后细胞骨架蛋白F-actin空间结构;电镜观察转染和联合刺激后的细胞超微结构。
　　结果:1.成功构建并转染Hcdc14A真核表达载体(pEGFP-C2-Hcdc14A质粒),重组质粒转染后Hcdc14A表达显著上调,发现其在细胞分裂期定位于纺锤体两极和中心体上。
　　2.重组质粒转染后Hcdc14A表达显著上调,同时cyclinB、cyclinD、cyclinE和P53蛋白表达均不同程度上调。
　　3.转染后细胞增殖率明显增加。
　　4.转染后caspase3活性有所增强。
　　5.转染后细胞周期S期和G2-M比例明显增加。
　　6.转染后细胞骨架蛋白F-actin出现解聚样改变。
　　7.电镜观察发现转染后少部分细胞呈现肿瘤化改变。
　　结论:过表达Hcdc14A可同时上调cyclinB、cyclinD、cyclinE和P53蛋白表达,加速细胞周期进程,提高细胞增殖率,促进细胞骨架蛋白F-actin解聚,同时也可能影响细胞凋亡进程。提示过表达Hcdc14A可同时影响相关周期蛋白表达和细胞周期进程,进而影响细胞的增殖和凋亡进程。
　　第三部分siRNA干扰Hcdc14A对相关周期蛋白表达及细胞增殖和凋亡的影响
　　目的:观察siRNA干扰Hcdc14A基因表达对相关周期蛋白表达及细胞增殖和凋亡的影响。
　　方法:设计合成3对靶向Hcdc14A特定序列的siRNA并转染细胞:RT-PCR和Western-blot验证Hcdc14A表达;Western-blot检测siRNA干扰对cyclinB、cyclinD、cyclinE和P53蛋白表达的影响;CCK8方法检测siRNA干扰后的细胞存活率;caspase2活性测定法观察siRNA干扰后的细胞凋亡;流式细胞术观察siRNA干扰后的细胞周期;荧光探针观察siRNA干扰后的细胞骨架蛋白F-actin空间结构;电镜观察siRNA干扰后的细胞超微结构。
　　结果:1.siRNA能显著下调Hcdc14A的mRNA和蛋白表达水平。
　　2.siRNA干扰还可同时下调cyclinB和cyclinD蛋白表达,上调P53蛋白表达,对cyclinE无明显影响。
　　3.siRNA干扰后细胞存活率明显下降。
　　4.siRNA干扰后细胞凋亡明显增加。
　　5.siRNA干扰后细胞周期中S期和G2-M比例明显减少。
　　6.siRNA干扰后细胞骨架蛋白F-actin呈现一定聚合样改变。
　　7.电镜观察发现siRNA干扰后凋亡细胞增多。
　　结论:siRNA干扰Hcdc14A基因表达的同时还可影响相关周期蛋白cyclinB、cyclinD和P53的表达,阻滞细胞周期进程,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,并可能对骨架蛋白F-actin空间结构产生一定影响。提示下调Hcdc14A基因表达可能引起整个细胞周期调控网络功能紊乱,导致细胞正常生理功能发生改变。
　　第四部分G-CSF对Hcdc14A和相关周期蛋白表达的影响及其细胞保护作用机制
　　目的:观察G-CSF对人脑血管内皮细胞Hcdc14A和相关周期蛋白表达的影响,初步探讨G-CSF对联合刺激后人脑血管内皮细胞的保护作用及其机制。
　　方法:不同条件G-CSF刺激人脑血管内皮细胞,CCK8法和caspase3活性测定法观察G-CSF对细胞增殖和凋亡的影响;XTT法和CCK8法检测G-CSF预处理不同时间对高糖、高FFA和低氧联合刺激后细胞增殖率和存活率的影响;Western-blot检测G-CSF预处理对Hcdc14A及相关周期蛋白表达的影响;流式细胞术和caspase3活性测定法观察G-CSF预处理对细胞凋亡的影响;流式细胞术检测G-CSF预处理对细胞周期的影响;荧光探针观察G-CSF预处理对细胞骨架蛋白F-actin空间结构的影响:电镜观察G-CSF预处理对细胞形态学的影响;荧光探针检测G-CSF预处理对活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)、内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)、钙离子(Ca2+)及线粒体膜电位(MMP)等氧化应激相关指标的影响;ELISA和免疫荧光等方法检测G-CSF预处理对PI3K/AKT和MAPK信号通路的影响。
　　结果:1.G-CSF刺激可促进细胞增殖并抑制细胞凋亡。
　　2.G-CSF预处理12h可明显提高联合刺激后的细胞增殖率和存活率。
　　3.G-CSF能够明显上调Hcdc14A、cyclinB和cyelinE蛋白表达,下调P53蛋白表达,对cyclinD无明显影响。
　　4.G-CSF预处理可明显抑制联合刺激诱导的细胞凋亡。
　　5.G-CSF预处理可上调S期和G2-M期细胞比例。
　　6.G-CSF预处理可促进细胞骨架蛋白F-actin解聚。
　　7.电镜观察发现G-CSF预处理后凋亡细胞有所减少。
　　8.G-CSF预处理可明显拮抗联合刺激诱导的氧化应激,上调NO、eNOS和MMP水平,降低ROS和Ca2+水平。
　　9.G-CSF可激活PI3K/AKT和ERK1/2信号通路,并抑制JNK和p38信号通路。
　　结论:G-CSF能够上调Hcdc14A和相关周期蛋白cyclinB、cyclinE蛋白表达,下调P53蛋白表达,调控细胞周期进程,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,拮抗高糖、高FFA和低氧联合刺激诱导的氧化应激,并可激活PI3K/AKT和ERK1/2信号通路,抑制JNK和p38信号通路。提示G-CSF可能是通过调控Hcdc14A和相关周期蛋白表达、拮抗氧化应激、影响PI3K/AKT和MAPK信号通路等多种机制发挥其内皮细胞保护作用。

目录

中文摘要

英文摘要

引言

第一部分 高糖、高游离脂肪酸和低氧刺激对Hcdc 14A和相关周期蛋白表达及细胞增殖和凋亡的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 过表达Hcdc14A对相关周期蛋白表达及细胞增殖和凋亡的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 siRNA干扰Hcdc14A对相关周期蛋白表达及细胞增殖和凋亡的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第四部分 G-CSF对Hcdc14A和相关周期蛋白表达的影响及其细胞保护作用机制

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

全文小结

综述

发表论文及参加学术会议

致谢