钙化型乳腺癌基于蛋白质组学技术的血清诊断模型的建立和钙化机制的研究

摘要

乳腺癌是严重危害妇女健康的一种恶性肿瘤，乳腺X线检查是目前全世界公认的应用于大范围人群乳腺癌筛查的最主要的影像学检查项目。乳腺x线筛查中经常会发现乳腺的钙化灶，同时乳腺癌也常常伴随钙化的表现，甚至有时钙化是临床现有乳腺癌检查手段所能发现的唯一征象。这对钙化病灶的良恶性鉴别提出了更高的要求。血清组分变化可充分反映机体生理、病理过程，容易获取并易于监测，故一直是筛选疾病诊断标记物的最佳研究对象。目前常用的乳腺癌血清标记物主要为CA15-3、CA12-5、CEA等，特异性和敏感性不能满足临床需求。为此，筛选血清中差异蛋白十分必要。
　　目前研究认为乳腺癌的发生发展是多因素参与的多环节的病理过程，传统的单基因研究模式限制了肿瘤相关因素的研究发展。近年来迅速发展的蛋白质组学研究，是对基因组所编码的所有蛋白质进行研究的学科，能动态、整体、定量地考察疾病发生发展过程中全部蛋白质种类和数量的变化，对于探讨疾病发病机理、寻找疾病诊断的特异性标志物和药物治疗的靶标来说，是一种有效的高通量的研究模式，可获得一些传统手段无法得到的新蛋白标志物、新关键分子，极大地丰富了诊断标志物的选择组合，并且有助于复杂致病机理的全面阐明。通过蛋白质组学的研究，使我们对肿瘤的发生、发展有了更详尽的理解，并能够通过发现特异的分子标志物来预测患者和治疗效果和预后。
　　表面加强激光解吸电离-飞行时间质谱(surface-enhanced laserdesorption/ionization，time-of-flight，mass spectroscopy，SELDI-TOF-MS)是蛋白质组学新兴运用的技术，已有众多的研究组利用该技术在患者体液中发现了能够早期诊断肿瘤的标志物。双向凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis，2-DE)是基于质谱测定的蛋白质组学的标准方法。基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization，time-of-flight，massspectroscopy，MALDI-TOF-MS)分析肽质量指纹图谱则是检测双向凝胶电泳分离的蛋白的常规工具。MALDI-TOF-MS通过计算肽的飞行时间进行分析，而飞行时间则和肽的质荷比相关。将获得的肽质量的数据和序列数据库中已知蛋白的数据进行比对，就可以获得较为明确的蛋白鉴定结果。
　　糖基化是最常见的蛋白质修饰，在恶性肿瘤中，大约50％以上的蛋白质都有糖基化发生。许多疾病的发生与蛋白质糖链结构异常有关。分析疾病相关的蛋白质糖基化改变，在探求疾病诊疗策略和发现诊断标志物方面扮演着越来越重要的角色。
　　本课题的研究目的就是希望通过临床工作中数字化乳腺X线检查结果，分析乳腺钙化的类型、分布、病理特征等规律，应用SELDI-TOF-MS技术通过对人钙化型乳腺癌、无钙化乳腺癌、良性钙化和良性无钙化对照组患者血清的蛋白质组表达谱差异分析，在乳腺X线提示钙化的乳腺癌患者的血清中寻找与钙化可能相关的分子标记物，建立乳腺癌，尤其是钙化型乳腺癌血清蛋白质组的诊断模型，对其进行验证和评价。并且应用2-DE和MALDI-TOF-MS技术筛选鉴定血清中与乳腺癌钙化的差异蛋白质分子，应用复合蛋白质组学(multiplexed proteomics，MP)技术，获得血清糖蛋白质修饰谱；然后应用免疫沉淀和多种凝集素印迹分析差异蛋白的糖链结构的改变与乳腺癌钙化发生的关系，为进一步探讨乳腺癌钙化的形成机制建立工作基础。
　　第一部分乳腺X线检查中乳腺钙化的特点与规律分析
　　目的：分析钙化在乳腺X线成像中的类型、分布、病理特征等规律。评价钙化在乳腺癌X线诊断中的意义。
　　方法：自2006年3月至2008年2月数字化乳腺X线检查的病人3812例，其中女性3807例，男性5例。乳腺X线摄影常规双乳拍摄头尾位(craniocaudal，CC)、外斜位(mediolateral oblique，MLO)。378例病人乳腺X线摄影检查后在我院接受了手术治疗。所有病灶均经手术后病理证实。观察分析乳腺钙化灶的大小、分布及病理特征。对64例浸润性导管癌标本进行雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和C-erbB-2免疫组织化学染色分析。采用x2检验和Fisher精确概率法进行统计，当P<0.05时差异有统计学意义。
　　结果：3812例病人中，乳腺X线摄影发现存在钙化灶的有201.8例，占52.9％，其中双侧乳房均有钙化的为1045例，占钙化病例的51.8％。乳腺良恶性病灶均可出现钙化，良恶性病灶组间比较，恶性钙化主要表现为病灶内的、簇状的、微小钙化，钙化的大小及分布特征的差异有统计学意义(P<0.05)。不同钙化的乳腺导管癌之间免疫组化指标阳性表达率的差异无统计学意义(P>0.05)。以簇状分布的微钙化作为乳腺癌的评判指标，诊断的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为41.7％(78/187)、86.7％(137/158)、78.8％(78/99)、55.7％(137/246)。结合X线其他表现，乳腺数字化X线摄影对乳腺癌诊断的总的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值59.9％(112/187)、92.4％(146/158)、90.3％(112/124)及66.1％(146/221)。结论：乳腺钙化在诊断不同乳腺疾病及鉴别良恶性肿瘤中具有重要作用。乳腺癌钙化主要表现为病灶内的、簇状的、微小钙化。
　　第二部分钙化型乳腺癌基于SELDI-TOF-Ms技术的血清诊断模型的建立
　　目的：建立蛋白质芯片SELDI-TOF-MS技术平台，寻找与乳腺癌，尤其是钙化型乳腺癌相关差异蛋白质，建立血清蛋白质指纹图谱诊断模型，并进行验证和评价。
　　方法：入组乳腺癌病例72例，其中钙化型乳腺癌组40例、无钙化乳腺癌组32例，入组良性病变54例，其中良性钙化组33例、良性无钙化组21例。对入组病例术前血清样品进行检测，以弱阳离子交换蛋白质芯片(CM10)为检测介质，经SELDI-TOF-MS测定，得到蛋白质指纹图谱并运用BioMarker Wizard软件分析比较，筛选差异蛋白，建立诊断模型。对所建立的诊断预测模型进行盲法验证以分析评估。
　　结果：
　　1.经CM10芯片检测出乳腺癌患者血清蛋白质质荷比(M/Z)一般在1500～50000范围内。同一芯片内蛋白质峰强度的变异系数(CV)值为0.161，M/Z的CV值为0.0004。不同芯片间蛋白质峰强度的CV值为0.16，M/Z的CV值为1.6×10-8。
　　2.与病灶良恶性相关的差异蛋白及由此建立的诊断模型：
　　(1)乳腺癌组与良性病变组比较，得到54个差异蛋白峰，其中19个有统计学意义(p<0.05)，在乳腺癌组表达上调的蛋白质有7个，按M/Z由小到大的蛋白质峰分别为8099、16204、16287、16465、16672、33123、40650，下调的有12个，分别为1746、1765、1771、1794、1842、1867、1888、1913、1934、1973、2025、9085。由M/Z分别为16465、15633、7890、9561、4396的5个差异蛋白峰建立诊断模型I，其敏感性为94.3％，特异性为97.6％。盲法验证结果敏感性为86.8％，特异性为85.7％。
　　(2)钙化型乳腺癌组与良性钙化组比较，得到61个差异蛋白峰，其中16个有统计学意义(p<0.05)，表达上调的蛋白质有6个，按M/Z由小到大的蛋白质峰分别为5987、9450、15633、16287、16465、33068，下调的有10个，分别为1842、1867、1890、1899、1913、1934、1954、1980、2025、3000。由M/Z分别为16465、9561、1792的3个差异蛋白峰建立诊断模型Ⅱ，其敏感性为89.3％，特异性为100％。盲法验证结果敏感性为100％，特异性为75.0％。
　　3.与病灶钙化相关的差异蛋白：
　　(1)钙化型乳腺癌组与无钙化乳腺癌组血清蛋白质峰比较，得到54个差异蛋白峰，其中14个有统计学意义(p<0.05)，在钙化型乳腺癌组表达上调的蛋白质有1个，为3358，下调的有13个，按M/Z由小到大的蛋白质峰分别为1746、1765、1771、1794、10448、14320、14427、15445、15633、16204、24142、2881.1、29008。
　　(2)良性钙化组与良性无钙化组血清蛋白质峰比较，得到60个差异蛋白峰，其中14个有统计学意义(p<0.05)，在良性钙化组表达上调的蛋白质有3个，按M/Z由小到大的蛋白质峰分别为3140、3358、6938，下调的有11个，分别为4704、5992、9452、10448、11943、15446、15658、24105、28811、29009、38365。
　　结论：运用SELDI-TOF-MS技术所建立的血清蛋白指纹图谱模型在诊断乳腺癌尤其是钙化型乳腺癌中具有非常高的敏感性与特异性，可望成为很好的诊断工具。有关钙化的差异蛋白的研究对乳腺癌钙化机制的理解具有重要意义。
　　第三部分钙化型乳腺癌血清比较蛋白质组学分析
　　目的：本部分应用双向凝胶电泳(2-DE)结合基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)等蛋白质组学技术，对钙化型乳腺癌、无钙化乳腺癌、良性钙化组、良性无钙化组患者血清蛋白质差异表达谱进行分析，筛选在乳腺癌的钙化形成过程中可能发挥重要作用的差异蛋白分子。
　　方法：选择钙化型乳腺癌、无钙化乳腺癌、良性钙化组、良性无钙化组患者血清各10例，将同一组标本混合后，去除高丰度蛋白(白蛋白和IgG)。应用非线性pH3-10，长18cm的IPG胶条和12％的SDS-PAG进行双向凝胶电泳分离总蛋白，每一组的混合样本均在相同条件下分别进行3次双向电泳以保证重复性。用Image Master软件对四组的血清蛋白质组表达谱进行差异分析，筛选差异3倍及以上且出现频率大于或等于50％的蛋白点，将蛋白胶内酶解后的肽段用MALDI-TOF-MS分析，获得差异蛋白的肽质量指纹图谱，数据送入NCBI非冗余数据库，通过MASCOT搜索引擎检索。
　　结果：各组检测到的蛋白点数如下：钙化型乳腺癌组345±129个，无钙化乳腺癌组329±40个，良性钙化组296±27个，良性无钙化组308±43个。筛选出差异蛋白点31个。从相应的银染胶中挖取差异较大、蛋白斑点较浓、分离较清晰的蛋白点进行胶内酶解，酶解后的肽段用MALDI-TOF-MS分析，所有差异蛋白点均得到鉴定。两两比较结果如下：①钙化型乳腺癌与良性钙化组比较：钙化型乳腺癌组血清中特异性的蛋白质2种，上调的蛋白质8种，下调的蛋白质7种；②钙化型乳腺癌与无钙化乳腺癌比较：钙化型乳腺癌组血清中特异性的蛋白质3种，上调的蛋白质5种，下调的蛋白质3种；③良性钙化与良性无钙化组比较：良性钙化组中血清中上调的蛋白质1种，下调的蛋白质4种。
　　结论：从查阅文献看本研究鉴定出的部分分子参与肿瘤的发生发展及机体代谢过程，从这些分子的生物学功能，推测这些蛋白可能与乳腺癌钙化的形成相关，为阐明乳腺癌钙化机理提供了一条新途径。
　　第四部分触珠蛋白作为差异蛋白的表达验证及其N-聚糖糖链特征研究
　　目的：对与乳腺癌钙化相关的差异蛋白触珠蛋白(haptoglobin，HP)进行表达验证，推测HP的N-糖链结构。
　　方法：收集钙化型乳腺癌、无钙化乳腺癌、良性钙化组、良性无钙化组患者血清各10例，通过免疫比浊法测定HP的蛋白含量；用免疫印迹验证各组HP的蛋白表达水平。分别再利用2-DE与Pro-Q Emerald488糖蛋白染料和SYPRO Ruby相结合的复合蛋白质组学(MP)技术，进一步研究HP这一类糖蛋白，利用Image master6.0软件计算各自的蛋白灰度vol％值；应用抗体免疫沉淀纯化HP，并应用western blot辅以几种常见的凝集素印迹，验证HP一类蛋白的凝集素结合特性，并推断其可能的糖链结构特征。
　　结果：免疫比浊法测HP的总含量(包括α和β链)变化趋势同2-DE结果一致。免疫印迹验证HP的β链表达同2-DE结果大致相同，均是钙化型乳腺癌组HP总含量多于无钙化乳腺癌组，且多于良性钙化组，但免疫印迹验证时良性钙化组HP总含量少于良性无钙化组。488糖蛋白染色和SYPRO Ruby总蛋白染色结果比对，发现HP-α2和HP的蛋白质表达水平的变化与其糖基化程度的变化一致，preprohaptoglobin的蛋白表达水平变化与其糖基化程度的变化不一致；HP多抗抗体免疫沉淀纯化HP-β链，不同的凝集素亲和印迹法对HP-B链进行糖链结构推断，HP-β链在钙化型乳腺癌和无钙化乳腺癌中对AAL和LCA的亲和力较强，其中在钙化型乳腺癌组对AAL和LCA的亲和力比无钙化乳腺癌组高，HP-β链在钙化型乳腺癌中对PHA-E和RCA-I的亲和力较强，以上几种凝集素在良性钙化组、良性无钙化组中几乎无亲和力，DSA和Con A在四组样本中均无亲和力。
　　结论：验证了HP在钙化型乳腺癌、无钙化乳腺癌、良性钙化、良性无钙化病例中蛋白表达水平。推测HP-B链在人不同血清样本中糖修饰谱的结构变化，它们也可能是影响乳腺癌钙化发生过程中的一个重要因素。HP含有末端、核心岩藻糖型和及末端半乳糖型糖链结构形式，恶性钙化的发生伴随着HP的核心和末端岩藻糖型糖基化程度的改变。
　　结论
　　1.乳腺钙化在诊断不同乳腺疾病及鉴别良恶性肿瘤中具有重要作用。乳腺癌钙化主要表现为病灶内的、簇状的、微小钙化。临床工作中迫切需要更多敏感、特异的肿瘤标志物来提高乳腺钙化型病变术前诊断的准确性。
　　2.SELDI蛋白芯片技术具有快速、操作简便、样品用量少和高通量等特点，运用SELDI-TOF-MS技术所建立的血清蛋白指纹图谱模型在诊断乳腺癌尤其是钙化型乳腺癌中具有非常高的敏感性与特异性，可望成为很好的诊断工具。有关钙化的差异蛋白的研究对乳腺癌钙化机制的理解具有重要意义。
　　3.运用2-DE和MELDI-TOF-MS技术在钙化型乳腺癌、无钙化乳腺癌、良性钙化组、正常无钙化组四组血清样本中鉴定出了31种差异蛋白。分析所鉴定出的蛋白，HP是其中之一，参与肿瘤的发生发展及钙磷代谢过程。
　　4.通过对HP的表达验证，我们推测HP家族可作为钙化型乳腺癌的潜在血清标记物，可能与乳腺癌特征性钙化的形成相关，值得进一步研究。应用MP技术结合2-DE显示血清糖蛋白表达谱，免疫沉淀和凝集素印迹研究HP N-糖基化修饰，推测钙化型乳腺癌其糖链结构除异常核心岩藻糖基化外，还伴随着其他糖链结构改变。
　　创新点
　　1.首次从血清蛋白质组学角度建立钙化型乳腺癌术前血清蛋白质指纹图谱；
　　2.首次从血清蛋白质组学角度建立钙化型乳腺癌的诊断模型；
　　3.首次应用比较蛋白质组学方法分析并鉴定了钙化型乳腺癌的血清差异蛋白谱。筛检出的差异蛋白质分子可以作为潜在的、有应用价值的测定钙化型乳腺癌的标志物。为今后研究乳腺癌钙化形成机制指明了可能的方向，为钙化型乳腺癌今后的靶向治疗提供了新的特异性的靶点。
　　4.首次分析了HP在乳腺良恶性病变钙化形成过程中的糖修饰谱的变化。