衣壳蛋白基因突变对登革病毒生物学性质的影响

摘要

登革病毒是一类有包膜的单股正链RNA病毒，基因组全长约11Kb，两端为非编码区，在其5’末端含有一I型帽子结构，3’末端无多聚A(PolyA)尾，其编码区为单一的开放读码框(ORF)，编码3种结构蛋白(C、PrM、E)和7种非结构蛋白(NSl、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5)。其中衣壳蛋白C位于病毒颗粒内部，与基因组RNA共同构成病毒核衣壳(NC)，在病毒RNA衣壳化和病毒颗粒组装过程中起重要作用。 随着感染性克隆技术的发展，以反向遗传系统为基础的新型减毒疫苗成为登革疫苗研究的热点。登革病毒减毒突变的靶标曾主要集中在基因组两端的非编码区及PrM-E区。其衣壳蛋白C一般认为是不可或缺的，但黄病毒的另一成员蜱传脑炎病毒(TBE)缺失衣壳蛋白内部疏水序列后，仍保持了增殖特性，且所获得的缺失突变病毒在毒力降低的同时免疫原性却得以保持。表明其衣壳蛋白具有一定的功能灵活性。黄病毒家族衣壳蛋白在结构上具有保守性，所有成员的衣壳蛋白均存在内部疏水序列。在病毒颗粒组装过程中，衣壳蛋白可通过此序列形成的疏水裂隙(hydrophobiccleft)与膜蛋白相结合。这样，在黄病毒衣壳蛋白内部疏水序列缺失后，可能获得生物学性质改变的突变病毒。本研究在登革病毒反向遗传系统的基础上构建衣壳蛋白缺失突变体，并对衣壳蛋白缺失突变对登革病毒生物学性质的影响加以研究，为深入探讨登革病毒基因组结构与功能的关系及研制新型登革减毒疫苗奠定基础。 为构建登革2型病毒中国分离株DEN2-43株的反向遗传系统，根据已由我室测定的DEN2-43病毒全基因组序列，利用长链RT-PCR及融合PCR法扩增此病毒长约11Kb的基因组全长cDNA分子，将其克隆至低拷贝载体pWSK29，经鉴定，获得了4株序列正确的全长克隆，其5’末端均含有外加的可进行体外转录的T7RNA聚合酶启动子核心序列。其中，全长克隆pD212的转录体RNA具有感染性，所获得的恢复病毒的细胞培养特性和乳鼠神经毒力与原毒株类似，并可在培养细胞和乳鼠脑中稳定传代。 为确定衣壳蛋白缺失片段的位置和长度，截取DEN2-43株病毒成熟衣壳蛋白所在的97．396nt序列，用DNASTAR软件对此序列进行分析，发现此序列有富含甘氨酸(Gly)的疏水区段和4个Q螺旋序列，其中第3个Q螺旋(45．59aa)与部分内部疏水序列(44—65aa)相重叠。研究表明该功能区与衣壳蛋白二聚体的形成、核衣壳的组装及病毒的成熟有关。另一方面，与衣壳蛋白其它位置相比，内部疏水序列可能更具有功能灵活性。因此，我们以衣壳蛋白的内部疏水序列为核心构建不同的缺失突变体，分别缺失DEN2-43病毒衣壳蛋白序列中41R和42G构建缺失单个氨基酸残基的突变体C(△41)和C(△42)，然后以4lR和42G为起点，分别缺失4、9、10和18个氨基酸残基构建缺失突变体C(△4144)、C(△41．49)、C(△42-51)和C(△42-59)，其中，突变体C(△41)、C(△42)和C(△41．44)缺失片段未涉及到内部疏水序列及第3个α螺旋，而C(△4149)、C(△42—51)和C(△42．59)则缺失了部分或全部的第3个α螺旋序列，但均保留了部分疏水序列。借此观察衣壳蛋白序列的不同区段，尤其是第3个α螺旋序列缺失对登革病毒生物学特性的影响。将获得的缺失突变体经XbaI酶切线性化后进行体外转录，转录体RNA电穿孔转染BHK21细胞24h后，通过间接免疫荧光在胞浆中可检测到DEN2-43病毒特异的蛋白。在电穿孔后第6天收取细胞培养上清，接种C6／36细胞，除缺失突变体C(△42—59)外，其它突变转录体RNA均可使C6／36细胞出现不同程度的细胞病变，表明我们获得了相应的衣壳蛋白缺失突变病毒。 为了观察缺失突变病毒培养特性的改变，用相同滴度的缺失突变病毒和未突变的恢复病毒分别接种C6／36细胞和LLC．MK2细胞，在接种后第l、2、3、4、5、6和7d分别收取细胞培养上清液，采用空斑滴定法测定病毒滴度PFU。结果显示，与DEN2-43毒株的恢复病毒相比，缺失突变病毒在细胞上的增殖能力随着缺失片段长度的增加有不同程度的减弱。缺失1个氨基酸残基的突变病毒D(△41)和D(△42)的增殖能力略有下降，且形成空斑的大小及出斑时间均与野生病毒及其恢复病毒相差无几。缺失4个氨基酸残基和9个氨基酸残基的突变病毒D(△4144)和D(△4149)的增殖能力则明显减弱，但这些突变病毒仍保持了与原型病毒相类似的增殖特征。缺失10个氨基酸残基的突变病毒D(△42．51)的增殖能力最差，且以近乎直线的形式增殖。 为了进一步探讨衣壳蛋白缺失突变对登革病毒乳鼠神经毒力的影响，将不同缺失突变病毒稀释为105～102PFU／ml，脑内接种乳鼠后观察不同缺失突变病毒在各个剂量组乳鼠的死亡数量和死亡时间。发现缺失突变病毒的乳鼠神经毒力均有不同程度的减弱，并且缺失区段越长，对应缺失突变病毒的乳鼠神经毒力越弱，致小鼠死亡的时间越长。缺失1个氨基酸残基的突变病毒D(△41)和D(△42)的毒力减弱，但在各滴度均可导致乳鼠死亡；缺失4个氨基酸残基和9个氨基酸残基的突变病毒D(△41．44)和D(△4149)在10s剂量组就不能使小鼠致死；缺失10个氨基酸残基的的突变病毒D(△42．51)则几乎完全丧失了乳鼠神经毒力。表明衣壳蛋白缺失突变可能影响了登革病毒成熟和感染的某些过程，并最终导致其神经毒力减弱。 为观察衣壳蛋白缺失突变对登革病毒免疫原性的影响，用缺失突变病毒免疫小鼠后第三周开始每周采血一次，用间接免疫荧光和中和实验法分别测定不同缺失突变病毒免疫小鼠的血清荧光抗体效价和中和指数。结果显示，与野生型病毒及其恢复病毒一样，缺失突变病毒免疫小鼠后均可诱导产生高水平的针对DEN243病毒的IgG抗体，且具有较高的中和活性。 本研究在DEN243病毒感染性全长cDNA克隆基础上，缺失以内部疏水序列为核心的衣壳蛋白特定序列后获得了免疫原性较高的减毒恢复病毒，表明登革病毒衣壳蛋白具有一定的功能灵活性，可以作为登革病毒减毒突变的靶标。这一结果为登革病毒致病的分子机制研究和黄病毒新型减毒疫苗的研制提供了新的思路和方法。

目录

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前言

第一部分登革2型病毒感染性全长cDNA克隆的构建与鉴定

第二部分登革2型病毒衣壳蛋白缺失突变病毒的制备与鉴定

第三部分衣壳蛋白缺失突变病毒生物学性质的研究

总结

参考文献

致谢

博士生期间撰写的论文及综述

英文缩略词表

综述

发表论文 登革2型病毒中国分离株感染性全长cDNA克隆的构建与鉴定