Wnt信号通路在肾母细胞瘤发生发展过程中作用的体外实验研究

摘要

背景：肾母细胞瘤是儿童最常见的肾脏原发性恶性肿瘤，约占儿童所有恶性肿瘤的8％，目前被认为是一种胚胎发育性肿瘤。wnt信号通路是一条在生物进化中极为保守的通路，参与了胚胎发育过程中的诸多领域，受到严格的调节。近年来研究发现，Wnt信号通路在肿瘤的发生中也具有重要的意义，在众多人类肿瘤发生中均存在Wnt信号通路的广泛活化，Wnt信号通路与肿瘤的关系正日益受到众多学者的关注。因此，从调控胚胎发育和肿瘤发生的共同途径Wnt信号通路研究入手，能否揭示肾母细胞瘤发生的可能机制?能否在Wnt信号通路中寻找到新的抗癌分子靶位以提高肾母细胞瘤治疗的临床疗效?这些研究对寻找新的治疗方法和提高肾母细胞瘤患儿的生存率，具有重要的临床价值和意义，而目前国内外尚未见相关报道。
　　 目的：本研究通过体外培养肾母细胞瘤细胞株SK-NEP-1，检测Wnt信号通路相关基因及蛋白在肾母细胞瘤中的表达情况；观察不同浓度的sFRP-1(secreted Frizzled Related Protein-1)干预Wnt信号通路对细胞增殖的影响；通过RNAi技术敲减Wnt信号通路中β-catenin基因，观察对SK-NEP-1细胞生长及Wnt信号通路的影响；检测17β-雌二醇(E2)和双酚A(Bisphenol A，BPA)干预对SK-NEP-1细胞生长及Wnt信号通路的影响；本实验将初步探讨Wnt信号通路在肾母细胞瘤发生发展过程中的作用及可能机制，为肾母细胞瘤靶向治疗寻找新的靶点并提供科学理论依据。
　　 材料与方法：
　　 1.SK-NEP-1的培养鉴定及sFRP-1蛋白干预对细胞增殖的影响：在含15％胎牛血清和1％青链霉素的McCoys5A培养基中培养肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞，观察细胞形态，绘制生长曲线；采用Envision两步法检测细胞中Vimentin、β-catenin、WTl、cK蛋白的表达；RT-PER方法检测Wnt信号通路中WNT4、sFRP1、CTNNB1、CCND1、MYC基因的表达，并与肾脏胚胎细胞293细胞比较；观察不同浓度sFRP-1干预Wnt通路对SK-NEP-1增值的影响：将SK-NEP-1常规培养扩增后分为：对照组；低剂量组sFRP-1(100～500ng/mL)；高剂量组sFRP-1(10μg/mL)；低剂量sFRP-1抗体组(100～500ng/mL)；高剂量sFRP-1抗体组(10μg/mL)，分别在干预后0、24、48、72hr用CCK-8试剂检测比较各组光吸收度值(AV)。
　　 2.β-catenin特异性siRNA对SK-NEP-1生长的影响及与Wnt通路的关系：采用HiPerFect转染试剂，经转染优化实验，将Qiagen设计的两种不同序列β-catenin特异性siRNA(small interfering RNA)瞬时转染到SK-NEP-1细胞中，实验分为4组：未转染组(UT)；阴性对照组(NS)；siRNA1组(S1)；siRNA2组(S2)，分别在转染后0、24、48、72hr用CCK-8试剂检测比较各组光吸收度值(AV)；在转染24hr后检测各组中CTNNB1、CCND1、MYC基因的表达水平；转染48hr后免疫荧光法检测各组中β-catenin表达水平；转染48hr后流式细胞仪AnnexinV-FITC/PI双染法检测各组细胞凋亡率差异。
　　 3.E2、BPA对SK-NEP-1生长的影响及与Wnt通路的关系：将SK-NEP-1细胞常规培养扩增后分为：对照组；加不同浓度17β-雌二醇组(E2)；加不同浓度双酚A组(BPA)，分别在干预后48hr用CCK-8检测比较各组光吸收度值(AV)；干预48hr后real time PCR检测各组中CTNNB1、CCND1、MYC的基因表达水平；干预48hr后免疫荧光法检测各组中β-catenin表达水平；流式细胞仪AnnexinV-FITC/PI双染法检测无血清培养24hr各组细胞凋亡率差异。
　　 结果：
　　 1.SK-NEP-1的培养鉴定及sFRP-1蛋白干预对细胞增殖的影响：SK-NEP-1为悬浮细胞，半贴壁生长，细胞倍增时间大约为24小时；免疫组化结果显示SK-NEP-1中Vimentin、WT1、β-catenin、CK均呈阳性表达；RT-PCR显示SK-NEP-1中sFRP1；CTNNB1；CCND1；MYC基因均有表达，且CTNNB1呈现高表达状态，提示SK-NEP-1细胞中有Wnt通路的激活。与胚胎细胞293相比较，两种细胞中sFRP-1均呈现高表达，而WNT4无明显表达。外源性sFRP-1蛋白干预Wnt通路的结果显示：低浓度sFRP-1(100～500ng/mL)及高浓度sFRP1抗体干预SK-NEP-1对细胞增殖无明显作用，而sFRP-1在高浓度(10μg/mL)时，干预24小时后对照组AV值为干预组的1.23倍，p<0.05；干预48小时后对照组AV值为干预组的1.25倍，p<0.05，干预组对细胞增殖有明显抑制作用，而在干预72小时后抑制作用减弱，对照组AV值为干预组的1.1倍，p>0.05。
　　 2.β-catenin特异性siRNA对SK-NEP-1生长的影响及与Wnt通路的关系：转染优化实验表明，SK-NEP-1细胞浓度在4.0×105/mL～1.0×106/mL之间，24孔板体系每孔100ul transfection complexes含6ul Hiperfect转染试剂可以获得满意的转染效率，而β-catenin特异性siRNA1和siRNA2干预浓度在100nmol/L时可以获得有效的抑制效应。分别在SK-NEP-1细胞中瞬时转染100nmol/L的S1和S2后24hr，转染组细胞数量较对照组明显减少，CCK-8检测各组AV值，UT组的AV值分别是S1组和S2组的1.25倍(p<0.01)和1.23倍(p<0.01)；48hr后UT组的AV值分别是S1组和S2组的1.48倍(p<0.01)和1.43倍(p<0.01)；72hr后UT组的AV值分别是S1组和S2组的1.27倍(p<0.05)和1.1倍(p>0.05)，转染24、48hr，细胞增殖明显受到抑制。转染24hr后S1和S2组β-catenin的mRNA分别被敲减了67％和73％，S1、S2组与UT组比较，下游基因CCND1、MYC的mRNA表达水平也明显下调，CCND1组间比较p<0.01；MYC组间比较p<0.05；而UT组与NS组比较，β-catenin、CCND1、MYC基因的P值均>0.05(Oneway，Bonferroni法)。转染48hr后免疫荧光检测各组中β-catenin表达，采用积分光密度/面积(IOD/Area)值分析比较各组β-catenin荧光强度，S1、S2组较UT、NS组明显减少，p<0.01(Nemenyi-Wilcoxson-Wilcox法)。干预48hr后流式细胞仪AnnexinV-FITC/PI双染法检测各组细胞凋亡率，S1、S2组凋亡率较NS组增加，p<0.05。
　　 3.E2、BPA对SK-NEP-1生长的影响及与Wnt通路的关系：免疫组化检测SK-NEP-1中无明显雌激素受体(ER)表达。CCK-8检测对照组与不同浓度E2、BPA干预组光吸收度值(AV)结果显示，5nmol/L的17β-雌二醇及5μmol/L的双酚A对SK-NEP-1有促增殖作用(p<0.05)。检测干预48hr后各组β-catenin及下游基因CCND1、MYC的mRNA的表达差异，各组间均无区别(p>0.05)，免疫荧光检测干预48hr后β-catenin在各组细胞中表达，采用积分光密度/面积(IOD/Area)分析比较各组β-catenin荧光强度，各组之间无明显区别(p>0.05)。流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染法检测各组细胞凋亡率无明显区别(p>0.05)。
　　 结论：
　　 1.肾母细胞瘤细胞株SK-NEP-1中存在Wnt通路的激活，其中sFRP-1、β-catenin基因在mRNA水平高表达，而Wnt-4基因无明显表达。
　　 2.肾脏在发育过程中，后肾胚胎细胞在向上皮细胞分化过程中，Wnt通路调节异常，sFRP-1高表达抑制了Wnt-4的正常表达，导致后肾的间质细胞向上皮细胞转化障碍，持续增殖，可能是肾母细胞瘤发生机制之一。
　　 3.加入低浓度sFRP-1(100～500ng/mL)或高浓度的sFRP-1抗体(10μg/mL)对SK-NEP-1细胞增殖无影响，而加入高浓度sFRP-1(10μg/mL)可以抑制SK-NEP-1细胞的增殖，表明高浓度的sFRP-1对SK-NEP-1增殖起抑制作用。
　　 4.瞬时转染β-catenin特异性siRNA可以抑制SK-NEP-1细胞增殖，促进细胞凋亡，细胞β-catenin蛋白表达降低，通路下游相关基因MYC及CCND1表达下调，表明β-catenin的激活在肾母细胞瘤发生发展过程中起着重要作用。
　　 5.SK-NEP-1中无明显雌激素受体的表达，但是17β-雌二醇及环境内分泌干扰物双酚A可以促进SK-NEP-1细胞的增殖。
　　 6.17β-雌二醇及环境内分泌干扰物BPA干预SK-NEP-1对Wnt通路β-catenin及下游基因的表达均无明显影响。