肝癌转移特征性聚糖谱改变及相应糖基转移酶基因表达差异研究

摘要

肝细胞肝癌(human hepatocellular carcinoma，HCC)在我国位居恶性肿瘤死亡率第二位，其复发和转移一直是影响肝癌治疗效果的重要因素。
　　 所有细胞都带有致密而复杂的共价键结合的糖链(又叫做聚糖或寡糖)。聚糖结构随肿瘤进程不同会出现特征性的改变。寻找特征性改变的聚糖，弄清其改变的意义对于肿瘤的监测、诊治及预后判断都具有重要价值。目前由于缺少高通量的糖分析技术，寻找肿瘤特征性聚糖改变的工作一直没有系统性的开展。凝集素芯片是2005年新出现的糖分析技术，可以高通量的解析样本的聚糖信息。本研究首次采用凝集素芯片比较了3株肝细胞：L02(正常肝细胞系)、Hep3B(不转移肝癌细胞系)、HCCLM3(高转移潜能肝癌细胞系)的细胞膜蛋白糖谱，筛选出Hep3B和HCCLM3细胞表面一系列和肝癌侵袭及转移相关特征性聚糖结构，并且建立了糖基转移酶基因芯片比较了Hep3B和HCCLM3的糖基转移酶基因表达谱，一方面用以解释HCCLM3细胞表面特征性聚糖结构的发生，另一方面探讨差异表达的糖基转移酶所涉及的细胞功能及与HCCLM3细胞系转移潜能的相关性。最后我们对其中一个差异表达的糖基转移酶β3GalT5进行基因沉默，分析了这一基因的改变对高转移肝癌细胞系HCCLM3的体外细胞行为学影响。
　　 第一部分、基于凝集素芯片的不同转移潜能肝癌细胞系膜蛋白聚糖谱比较和特征性聚糖的筛选
　　 目的：本部分旨在评估凝集素芯片技术筛选复杂生物系统中聚糖谱改变的适用性，并以此为基础筛选可能和肝癌细胞系Hep3B、HCCLM3侵袭及转移潜能相关的特征性聚糖谱。
　　 方法：选取1对模式细胞：中华仓鼠卵巢细胞CHO和其N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-Ⅰ(N-acetylglucosaminyltransferaseⅠ)缺陷株Lecl，两株细胞的膜蛋白具有已知的特征性的寡糖表达差异。采用Cy3标记完整细胞膜，液氮速冻终止标记后，Merk天然膜蛋白提取试剂盒提取细胞膜蛋白，免疫印迹法鉴定膜蛋白提取的纯度，蛋白定量后每格凝集素芯片围栏10μg上样，经芯片孵育、清洗、扫描及统计分析后获得细胞膜蛋白和凝集素结合谱，根据不同凝集素对聚糖的结合特异性，推断膜蛋白聚糖谱，并比较不同细胞聚糖谱表达差异。前后3批制备的样本及同一批样本重复上样，检测芯片系统的重现性。随后选取人肝细胞系：L02、Hep3B、HCCLM3如前述方法提取膜蛋白，荧光标记，并进行凝集素芯片检测，获取不同肝细胞的细胞膜寡糖谱表达差异，并采用细胞表面凝集素组织化学技术验证凝集素芯片结果。
　　 结果：显示凝集素芯片技术捕捉到细胞系CHO和Lecl的膜蛋白特征性寡糖表达差异，即Lecl由于缺少N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-Ⅰ，杂合型和复杂型聚糖表达减少，高甘露糖型聚糖代偿性合成增多。
　　 比较L02、Hep3B的细胞膜糖谱，发现Hep3B对凝集素Cont、AAL、PHA-L、MPL的亲和增强，对WGA亲和减弱，提示细胞表面甘露糖，末端岩藻糖，β1-6分支聚糖及粘蛋白T抗原聚糖结构增多而N-乙酰葡糖胺结构和/或多价唾液酸结构的减少。比较Hep3B和。HCCLM3的细胞膜聚糖谱，发现HCCLM3对凝集素。LCA、PHA-E、MAL-Ⅰ、MAL-Ⅱ、WGA的的亲和增强，对RCA-Ⅰ亲和减弱，提示细胞表面可能出现核心岩藻糖、平分型GlcNAc、α2-3连接唾液酸和/或N-乙酰葡糖胺结构表达增高以及末端β1-4连接半乳糖结构表达减少。细胞表面凝集素组织化学验证的结果和芯片结果一致，证明芯片结果是可靠的。经过与文献比较，这些发生改变的聚糖可能是肝癌侵袭和转移相关的特征性聚糖。
　　 结论：本部分研究表明凝集素芯片技术是解析肿瘤相关病理过程中糖谱改变的适用工具，可用于寻找临床肿瘤相关特征性糖谱，筛选用于肿瘤诊断的糖标记；同时这一研究也为评价复杂生物系统中聚糖与生物学功能的关系提供了参考和技术平台。
　　 第二部分、不同转移潜能肝癌细胞系糖基转移酶基因表达谱比较及其与细胞膜聚糖谱的关系
　　 目的：本部分旨在比较不同转移潜能肝癌细胞系糖基转移酶基因表达谱差异，从糖基转移酶基因水平的表达情况来解释不同转移潜能肝癌细胞膜蛋白糖谱差异表达情况，并探讨表达改变的基因对肝癌细胞系转移行为的意义。
　　 方法：从功能糖组学网站http：//www.functionalglycomics.org数据库筛选参与肿瘤相关聚糖合成的基因115个，其中包含90个糖基转移酶，10个糖苷水解酶和5个糖核苷酸转运子，合成探针点制糖基转移酶基因芯片。芯片上同时设置阳性对照、阴性对照、点样阳性对照以及外标作为芯片质控。选取人肝癌细胞系Hep3B和HCCLM3，用Trizol法提取RNA，逆转录获得cDNA，经荧光标记后进行芯片杂交。选取差异倍数≧2或是≦0.5的基因，统计学方法分析差异显著性，并经生物信息学分析差异基因可能涉及的聚糖结构合成通路及功能网络。选取其中5个基因通过Real-time PCR方法验证芯片结果。
　　 结果：人肝癌细胞系Hep3B和HCCLM3比较，18个基因在HCCLM3中表达上调，11个基因表达下调。表达改变的基因主要涉及N-聚糖，O-聚糖粘蛋白sialyl Tn抗原、血型糖脂、红细胞糖苷脂、sialyl lewis a(sLea)、sialyl lewis x(sLex)抗原合成。比对这两株细胞的凝集素芯片亲和谱与糖基转移酶基因表达谱，发现糖基转移酶基因FUT8、MGAT3、ST3Gal的上调分别对应凝集素芯片上LCA、PHA-E、MA L-Ⅰ、Ⅱ亲和信号增强。结合IPA工具分析差异基因涉及的功能网络图，发现MGAT3、ST3Gals、β3GalT5、β3Gn-Ts、FUT等基因通过改变对黏附分子或其受体的修饰和表达量来影响细胞的黏附；MGAT5等通过协同或独立刺激血管生长因子分泌促进血管生成；MGAT5等基因也可以通过调节功能网络中重要节点分子如TGF-β受体的表达，影响其后续的多种信号通路，参与细胞的凋亡增殖等。这些表达改变的基因可能通过调节细胞的黏附、血管生成及增殖凋亡共同影响HCCLM3的转移行为。
　　 结论：本部分研究建立并比较了不同转移潜能人肝癌细胞系的糖基转移酶基因表达谱，一方面解释了不同转移潜能肝癌细胞表面特征性聚糖谱的发生；另一方面也为研究肝癌转移的机制及寻找肝癌转移干预靶点奠定基础。
　　 第三部分、β3GalT5基因沉默对人高转移肝癌细胞系的体外细胞行为学影响
　　 目的：本部分旨在通过RNA干扰技术研究糖基转移酶β3GalT5(β1-3半乳糖苷转移酶Ⅴ)在人高转移肝癌细胞系HCCLM3中缺失和降低表达后对细胞增殖、凋亡、周期、黏附、侵袭、运动的影响。
　　 方法：体外化学合成β3GalT5序列特异性双链RNA(siRNA-β3GalT5)，与Lipofecta-mine2000结合后转染细胞，采用Real-time PCR检测β3GalT5基因水平表达，观察siRNA-β3GalT5/Lipofectamine2000对β3GalT5表达的抑制作用。采用流式细胞仪测定细胞周期和凋亡，CCK-8试剂盒测定细胞增殖活力，细胞侵袭迁移实验检测细胞的侵袭迁移能力。
　　 结果：siRNA-β3GalT5在浓度为80nM，干扰时间为48小时时可以获得最高干扰效率81％。细胞行为学实验表明β3GalT5基因沉默后对细胞的增殖、凋亡、细胞周期都没有显著影响，但细胞的黏附减少，细胞的侵袭运动能力减弱。由于β3GalT5是合成sLea结构的关键分子，可能是基因沉默后sLea合成减少，与黏附分子选凝素的结合减少，影响了HCCLM3细胞的黏附及侵袭迁移。而对于细胞增殖、凋亡、细胞周期，尚无报道显示β3GalT5有直接或间接影响，可能β3GalT5不是参与这些细胞行为的关键分子。
　　 结论：本部分研究表明β3GalT5的表达与人肝癌细胞系HCCLM3的黏附及侵袭运动能力成正相关，与细胞的增殖、凋亡、细胞周期无明显相关性。干预β3GalT5的表达可能是干预肝癌转移的潜在途径。
　　 全文结论：
　　 1.凝集素芯片技术是解析肿瘤相关病理过程中糖谱改变的适用工具。
　　 2.与代表正常肝细胞的L02相比，甘露糖、末端岩藻糖、β1-6分支聚糖及粘蛋白T抗原聚糖结构的增多和N-乙酰葡糖胺结构和/或多价唾液酸结构的减少是人肝癌细胞系Hep3B表面聚糖结构的特征性改变，可能和肝癌生长侵袭相关。
　　 3.与不转移人肝癌细胞系Hep3B相比，细胞表面核心岩藻糖、平分型GlcNAc、α2-3连接唾液酸结构的增多是高转移人肝癌细胞系HCCLM3特征性聚糖结构，可能和肝癌转移相关。糖基转移酶基因FUT8、MGAT3、ST3Gal的表达上调是导致这些聚糖结构改变的原因。
　　 4.建立并比较了不同转移潜能人肝癌细胞系的糖基转移酶基因表达谱。差异表达的糖基转移酶基因主要通过调节细胞的血管生成、黏附及凋亡影响细胞的转移。
　　 5.β3GalT5的表达与人肝癌细胞系HCCLM3的黏附及侵袭运动能力成正相关，与细胞的增殖、凋亡、细胞周期无明显相关性。
　　 潜在应用价值：
　　 1.凝集素芯片技术可用于寻找临床肿瘤特征性相关糖谱，筛选可用于肿瘤诊断的更好糖标记。同时这一研究也为评价复杂生物系统中聚糖与生物学功能的关系提供了参考和技术平台。
　　 2.筛选出的Hep3B及HCCLM3细胞特征性聚糖结构是潜在的肝癌侵袭及转移糖标记。
　　 3.肝癌细胞系Hep3B及HCCLM3的糖基转移酶基因表达谱为研究肝癌转移的机制及寻找干预靶点提供了信息。
　　 4.干预β3GalT5的表达可能是干预肝癌转移的潜在途径。
　　 创新点：
　　 1.采用凝集素芯片技术系统筛选人肝癌细胞系侵袭及转移相关特征性糖谱。
　　 2.首次建立并比较了不同转移潜能人肝癌细胞系的糖基转移酶基因表达谱。
　　 3.β3GalT5对人肝癌细胞系体外行为学的影响是首次报道。