胰岛素样生长因子结合蛋白-2参与斑马鱼胚胎心血管系统发育的实验研究

摘要

胰岛素样生长因子结合蛋白(Insulin-like growth factor binding proteins,IGFBPs)是一组在生物进化过程中高度保守的分泌蛋白家族,属于胰岛素样生长因子信号传导系统超家族成员。IGFBPs通过调节循环中胰岛素样生长因子的半衰期及其生物活性发挥其内分泌调控作用。IGFBPs在胚胎期多种器官组织中高度表达,提示其可能在胚胎发育的过程中扮演重要角色。已有研究证实IGFBPs在体外可以诱导促进特定系细胞株向成熟的心肌和血管内皮细胞分化,IGFBP-4对于爪蟾胚胎的心脏发生具有正向调节作用。进一步探索IGFBPs在胚胎心血管系统发育中的作用将有助于我们更好的理解人类出生缺陷特别是先天性心脏病的发病机理和分子机制,为更有效地预防控制疾病提供新的思路。
　　近年来斑马鱼已成为研究脊椎动物胚胎早期发育,特别是心血管系统和心脏发生的理想模式动物。首先,斑马鱼的基因表达图谱已经明确,心血管系统发育过程与哺乳动物比较存在高度的相似性;其次,斑马鱼体外受精发育、早期通体透明,借助光学显微镜可以清楚实时地观察到心脏的发育情况;最重要的是,由于可以通过渗透作用从外界环境中被动获取氧,因此即使其循环系统存在严重畸形的情况下也能够存活较长时间。上述原因使斑马鱼在胚胎心血管系统发育的研究中具备独特的优势。
　　第一部分胰岛素样生长因子结合蛋白-2在进化中高度保守以及IGFBP-2基因在斑马鱼胚胎发育早期的时空表达谱
　　利用生物信息学方法证明生物进化过程IGFBP-2基因及蛋白的结构和功能高度保守。利用反义RNA探针标记的胚胎整体原位杂交技术分析IGFBP-2基因在斑马鱼胚胎发育早期的时空表达谱。IGFBP-2基因的杂交信号在野生型斑马鱼胚胎的双侧眼球、中枢神经系统(主要在中脑)和原始肝脏先后出现,72hpf以后主要集中表达于胚胎肝脏,而发育早期在胚胎心血管局部并无表达。
　　第二部分建立IGFBP-2 MO基因表达下调的斑马鱼模型以及IGFBP-2下调后斑马鱼胚胎心脏发育的异常表型
　　设计合成吗啡啉修饰的反义寡核苷酸特异性抑制IGFBP-2基因的翻译起始位点,通过MO显微注射技术建立斑马鱼胚胎IGFBP-2基因表达下调的模型。详细观察记录48和72hpf野生型组、Con-MO组以及IGFBP-2 MO不同注射剂量组之间斑马鱼胚胎的发育情况和出现心脏异常表型的比例。0.25mmol/L MO注射组胚胎自24hpf起依次出现心率下降、心包水肿、心房扩张、心室搏动无力,房室环化障碍等心脏畸形,部分胚胎存在不同程度的循环瘀滞和瓣膜反流。IGFBP-2 MO的注射剂量与胚胎心脏的异常表型存在剂量一效应关系。接受IGFBP-2 MO与IGFBP-2 EGFP重组质粒共注射的胚胎12hpf绿色荧光蛋白表达明显减弱,而野生型和Con-MO组的荧光蛋白表达正常。该结果验证了IGFBP-2MO的有效性,即其能够针对抑制斑马鱼胚胎内源性IGFBP-2的基因表达。
　　第三部分 IGFBP-2 Mo基因下调对斑马鱼胚胎心脏发育标志基因表达、外周血管发育以及对Vmhc-EGFP转基因鱼心室特异绿色荧光蛋白表达的影响
　　既然IGFBP-2表达下调严重干扰斑马鱼胚胎的正常心脏发育,我们将进一步研究其对斑马鱼胚胎心脏发育标志基因的表达和外周血管发育的影响作用。胚胎原位杂交结果显示心房特异性标志基因Amhc的表达下调;IGFBP-2基因下调的Vmhc-EGFP转基因斑马鱼48hpf心室特异性绿色荧光表达减弱；显微荧光血管造影显示IGFBP-2 MO组胚胎60hpf体节间血管显影稀疏紊乱,提示IGFBP-2同样参与斑马鱼胚胎外周血管的正常发育。