Commexin43在斑马鱼胚胎心血管系统发育中的作用

摘要

Cx43是第一个在心肌和其他组织发现并且是表达最广泛的一个连接蛋白。已经发现cx43的基因突变与许多人类的发育缺陷有关,包括耳聋、外周神经病和先天性的心脏病以及血液系统疾病。研究cx43基因在个体发育中的作用有助于理解各种相关先天性疾病特别是心血管疾病的发生的机制,为治疗提供新的思路。在已有的研究中已经证实,cx43的基因敲除小鼠在胚胎期表现出明显的心脏发育缺陷,主要是右心室和流出道的畸形,但是其确切的机制还有待于进一步的阐明。
　　 由于cx43的基因敲除导致哺乳动物的胚胎致死或出生后不久死亡,难以深入研究其对心血管系统的作用。而斑马鱼是近年来出现的一种良好的模式生物,其体型较小可以通过渗透作用提供氧气和营养,所以即使心血管有严重的畸形也可以存活较长的时间。此外斑马鱼胚胎发育期,通体透明便于观测,且心脏发育在进化上与哺乳动物具有高度的保守性,因此斑马鱼被认为是研究心血管早期发育良好的模式生物。所以利用斑马鱼研究cx43在心血管系统发育中的作用具有独特的优势。
　　 第一部分利用生物信息学的方法证明cx43在脊椎动物的进化过程中,结构和蛋白的功能结构域上非常保守。并且用RNA全胚胎原位杂交的方法和RT—PCR技术对cx43基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中表达谱进行了研究。
　　 第二部分设计了两个吗林修饰的反义寡核苷酸干扰cx43翻译起始位点,建立了cx43基因表达下调的斑马鱼模型。为了验证吗啉修饰的反义寡核苷酸的有效性,将其与编码cx43-EGFP融合蛋白的cx43-E6FP DNA共注射,结果显示cx43-MO抑制了cx43-EGFP融合蛋白的表达,从而也验证了cx43-mo能够有效抑制内源性的cx43的表达；同时也验证了cx-43-mo的特异性。
　　 第三部分cx43基因表达下调后用原位杂交和原位免疫荧光检测心脏标志基因的表达以及心脏的表型,同时利用显微荧光造影和原位杂交检测血管的发育情况。用心室心房的标志基因vmhc和amhc反义RNA探针进行的原位杂交结果显示vmhc表达下调,而amhc表达上调；原位免疫荧光显示与原位杂交一致的结果:心房扩张心室缩小,并且心脏环化不全。用血管标志基因flk-1的RNA探针原位杂交和显微荧光造影表明cx43基因表达下调的斑马鱼胚胎血管无明显缺陷。此外cx43基因表达下调的斑马鱼胚胎心脏功能也有明显改变,包括心脏搏动无力,有血液回流现象。但是下调cx43基因的表达对胚胎血管系统发育无明显干扰作用。
　　 第四部分研究证明:cx43在内细胞团(ICM)有明显表达。Cx43基因表达下调导致红细胞生成严重减少,和血细胞堆积。原位杂交显示cx43基因表达下调对造血祖细胞没有明显影响但是会导致造血干细胞数量显著减少。Cx43基因表达下调导致ICM和第四脑室的明显水肿。因此可以认为cx43是斑马鱼胚胎早期正常原始造血功能所必须的。