超临界CO2流体技术制备纳豆激酶口服制剂的研究

摘要

本实验室前期研究了纳豆激酶(Nattokinase,NK)的结构特点和特殊的理化性质,克隆了NK的全长基因,构建了大肠杆菌/枯草杆菌穿梭表达质粒,实现了在枯草杆菌中的高效表达,开始研制基因工程重组纳豆激酶(recombinantNattokinase,r-NK),并优化了发酵体系及纯化工艺,同时也对超临界C02流体技术进行肠溶衣的包衣进行了探索性研究。作为具有活性的生物大分子,NK直接口服的生物利用度不高。NK在pH6～12,50℃以下时均较稳定;具有抗胃蛋白酶及胰蛋白酶性能,但对酸性环境敏感;因此要提高NK口服后的生物利用度,最重要的是防止胃酸环境的破坏,同时防止肠消化酶的降解,促进NK在回肠后段及结肠部位靶向吸收[1,2]。本课题利用超临界C02流体技术以酸性环境敏感的肠溶材料Eudragit(?)L100-55对NK的载药微丸进行包衣制成包衣微丸,对包衣微丸的抗酸能力及释放行为进行了考察,并最终完成了药效学及生物利用度的研究。主要研究:1.r-NK摇瓶发酵表达,纯化,冻干。2.优化超临界C02流体技术包衣工艺,并制备r-NK包衣微丸。3.制备r-NK兔源多克隆抗体。4.探索r-NK包衣微丸药效学和生物利用度研究方法,并最终完成药包衣微丸的药效学及生物利用度研究。我们选择超临界C02流体作为反应体系,在乙醇作为助溶剂,柠檬酸三乙酯作为增塑剂和滑石粉作为抗粘剂的条件下,以酸性环境敏感的肠溶材料Eudragit(?)L100-55对r-NK的载药微丸进行包衣。根据预实验,包衣工艺受多种因素影响,主要有温度、压力、包衣材料和载药微丸比例、搅拌棒转速、助溶剂乙醇、抗粘剂滑石粉和增塑剂柠檬酸三乙酯的用量和配比以及反应时间等。经过实验室长期的摸索,结果显示最适反应条件为:包衣材料和载药微丸质量比为1:2,反应压力和温度分别为20MPa,35℃,增塑剂柠檬酸三乙酯及助溶剂乙醇均为10％(v/m),抗粘剂滑石粉虽对包衣反应稍有影响,但能显著改善微丸粘连问题。体外实验结果表明包衣微丸在模拟胃酸(pH1.2)环境中2h仅释放9.7%,并能保持近90%的活性状态,在pH6.8的模拟肠液中4h内快速释放达90%,以超临界C02流体技术制备的r-NK包衣微丸,在模拟胃酸环境中几乎不释药,可避免胃酸环境对r-NK活性的破坏;在pH6.8的模拟肠液环境中药物释放快速而完全,有利于r-NK在肠道中的吸收。药效学实验结果显示,超临界包衣制成的r-NK包衣微丸给药后能明显延长动物的aPTT值,血液中FIB浓度明显降低以及FDP浓度显著升高,给药后4小时达最高峰,具有统计学显著性差异;同时生物利用度实验结果显示,无论是体外,静脉还是经口服灌胃给药后取得的血清经处理,都能用Westernblotting的方法将r-NK检出。结果表明,经超临界C02流体包衣制成的r-NK包衣微丸经口服灌胃后,成功抵抗胃酸的降解而到达肠道中被释放,并被肠粘膜吸收入血而发挥作用,同时也证实了r-NK具有明显的溶解纤维蛋白的能力,具有明显的溶栓作用,并且显示出一定的量效关系。表明包衣制剂有助于促进r-NK的吸收,提高其生物利用度。该结果为r-NK口服制剂的进一步研究提供了有力的实验数据。

目录

英文缩写

中文摘要

Abstract

前言

第一部分 重组纳豆激酶中试研究

引言

材料和方法

结果

讨论

小结

第二部分 超临界CO_2流体技术制备重组纳豆激酶口服包衣微丸的研究

引言

材料和方法

结果

讨论

小结

第三部分 重组纳豆激酶兔源多克隆抗体的制备

引言

材料和方法

结果

讨论

小结

第四部分 重组纳豆激酶包衣微丸的药效学,生物利用度研究

引言

材料和方法

结果

讨论

小结

全文总结及展望

参考文献

综述

参考文献

附注

致谢