不同1p杂合性缺失特征少枝胶质瘤的差异蛋白质组学研究

摘要

胶质瘤是颅内最常见的肿瘤,发病率高,但治愈率低。尽管外科新技术的发展以及化疗、放疗的广泛应用使得胶质瘤的预后有所改善,但是大多数胶质瘤的预后仍然较差。少枝胶质瘤(Oligodendroglioma,OG)是胶质瘤的主要类型之一,占胶质瘤的4-15％,占所有原发脑肿瘤的2-5％,由于近年来发现其对化疗较为敏感、预后较好而成为胶质瘤研究的热点。近期研究发现这些对化疗敏感的少枝胶质瘤大都有1p/19q的杂合性缺失(Loss of heterozygosity,LOH)。进一步的研究显示具有不同1p/19qLOH(或1pLOH)特征的这两类肿瘤在很多方面还有差异,如好发部位、肿瘤对放疗的敏感性及最终的预后等等。这些都说明在光镜下无法区分的这两种肿瘤可能是两类分子生物学特征不同的肿瘤,对它们的分型可能有助于临床的治疗和预后的判断。但是目前除了1p/19q染色体的差异以外,人们对这两类肿瘤的其它差异如基因表达、蛋白差异乃至最终的分子生物学机制仍然知之不多,所以有必要对此进一步的研究。
　　蛋白质组学分析是一个能同时研究大量蛋白质及其表达变化的方法,正逐渐应用于从基础科学到临床实践科学的广泛领域中,受到前所未有的重视。在人类基因组计划的推动下,人们从基因水平对肿瘤进行了广泛的研究,并且发现了许多与肿瘤相关的基因,包括一些与肿瘤治病有关的致癌基因和抑癌基因,但基因的功能活动最终要靠蛋白质来体现。众所周知,从DNA-mRNA-蛋白质的过程中存在着转录后剪切和翻译后的修饰加工,以及蛋白质合成后的转移定位等多种变化,所以DNA和mRNA的水平和状况并不完全代表蛋白质的水平和状况。而以往的蛋白质研究方法如Western blot等一次只能对一个或几个蛋白质的表达进行研究。但我们现在知道肿瘤的分子生物学机制都是涉及成百上千个蛋白活动的过程,因此,有必要从蛋白质整体水平来研究、寻找出与肿瘤相关的特征蛋白质,阐明其机制。同位素标记相对和绝对定量(iTRAO)技术是近年来新开发的一种蛋白质组学定量研究技术,具有较好的定量效果、较高的重复性,并可对多达8种不同样本同时进行定量分析。因此,ITRAQ标记一串联质谱分析技术是寻找疾病和肿瘤发生过程中的标志性蛋白或者称为Biomarker的理想方法。我们此次使用iTRAQ技术结合多维液相色谱串联质谱(2D-LCMS/MS)对不同1pLOH特征的少枝胶质瘤组织进行比较蛋白质组分析,寻找特异蛋白作为诊断标志并进一步探求不同少枝胶质瘤的发病机制。
　　第一部分荧光原位杂交技术检测少枝胶质瘤1p染色体的杂合性缺失
　　目的:研究少枝胶质瘤中1p染色体的杂合性缺失。
　　方法:使用荧光原位杂交技术对16例少枝胶质瘤标本及5例正常对照脑组织行1p染色体检测。
　　结果:在16例少枝胶质瘤中有10例有1p染色体的杂合性缺失,占62.5％,其中6例Ⅱ级肿瘤中有5例缺失,10例Ⅲ级肿瘤中有5例缺失。
　　结论:1p染色体杂合性缺失是少枝胶质瘤的重要分子生物学特征,通过荧光原位杂交技术,我们可以对这两类少枝胶质瘤有效地加以区分,并用于进一步的临床诊断和治疗。
　　第二部分基于iTRAQ技术的少枝胶质瘤差异蛋白质组分析
　　目的:对不同1pLOH特征的少枝胶质瘤进行差异蛋白质组分析,寻找特异蛋白用于诊断和治疗。
　　方法:使用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术结合多维液相色谱串联质谱(2D-LCMS/MS)的定量蛋白质组学方法对8例不同1pLOH特征的两组少枝胶质瘤进行分析,并用DAVID、KEGG软件对数据进一步处理行生物信息学分析,通过统计分析找出差异蛋白质。
　　结果:通过蛋白质组分析在8例少枝胶质瘤中共鉴定得到449个蛋白质,统计分析发现HMGB1、MAP2、TMSB4X、LRPAP1、MARCKSL1、RPLP2、CISD1、ATP6V1E1、PSAP、PPIF、ARPC5L这11个蛋白在1pLOH的OG中表达较1p正常组肿瘤高,UBA1、PRKAR1A两个蛋白在1p正常的OG中表达较1pLOH组肿瘤高。
　　结论:在两组不同1pLOH特征的少枝胶质瘤中找到多个有差异表达的蛋白质,较其它蛋白质组学方法找到的蛋白谱范围更广;生物信息学分析显示Actin cytoskeleton通路的不同可能与这两类肿瘤的不同机制有关,HMGB1、UBA1可能与OG的化疗敏感性有关,MAP2可能与OG的预后有关,ATP6V1E1可能与代谢酶的失调有关。
　　第三部分HMGB1、MAP2、UBA1、ATP6V1E1蛋白在不同1pLOH特征的少枝胶质瘤中的表达及其意义
　　目的:验证HMGB1、MAP2、UBA1、ATP6V1E1等差异蛋白在不同1pLOH特征的少枝胶质瘤中的表达并分析其意义。
　　方法:使用Western blot对两组肿瘤中的差异蛋白质UBA1、ATP6V1E1进行验证;并用免疫组化方法对UBA1、ATP6V1E1、MAP2、HMGBl在39例扩大样本中的表达进行验证。
　　结果:Western blot结果显示UBA1在1p正常组OG中的表达量高于在1pLOH组中的表达量,ATP6V1E1在1pLOH组OG中的表达量高于1p正常组OG中的表达量;免疫组化对扩大样本的HMGB1、MAP2、ATP6V1E1的半定量分析结果显示在1pLOH组OG中的表达较1p正常组高,UBA1的表达在1p正常组OG中较1pLOH组高。
　　结论:Western blot和免疫组化结果均与蛋白质组学分析结果一致;这些特异蛋白都有望用于免疫组化诊断实现对OG的分子分型,并进一步用于OG的预后判断和指导治疗。