自闭症模型大鼠脑区Wnt/β-catenin通路相关基因甲基化修饰及通路活性变化的研究

摘要

自闭症(autism)是一种广泛性神经发育障碍性疾病,一般于3岁前发病,主要表现出语言交流艰难、社会交往障碍、重复刻板行为三大核心临床症状。此外,autism患者多有个显著头部发育特征,即2～5岁时脑过度增长,大于同龄健康儿童。目前,autism的发病原因尚不清楚,普遍认为是遗传因素和环境因素共同作用的结果,如妊娠早期丙戊酸盐(Valproate,VPA)暴露会大大增加子代罹患autism的风险。
　　Wnts蛋白是一类参与神经系统发育的重要信号分子,在经典Wnt信号通路中,Wnts蛋白与细胞表面卷曲蛋白受体(Frizzled,Frz)结合而激活下游的散乱蛋白(Dishevelled,Dv1),随后抑制GSK-3β、Axin和APC等分子复合体的形成,从而减少胞浆内β-catenin的降解。β-catenin蓄积并进入细胞核内,与TCF/LEF转录因子结合、诱导相关基因转录,产生一系列生物学效应。据报道,多种神经精神性疾病,如autism、精神分裂和抑郁症等,都可能与Wnt信号通路异常有关。有资料显示wnt2基因的突变与autism的发病有显著的相关性:动物实验表明,敲除了Wnt通路中dvl-1基因的小鼠表现出类似autism的社会行为障碍,也强烈提示Wnt信号通路与autism的发病有关。研究表明,表观遗传机制参与了autism的发病。DNA甲基化修饰是一种重要的表观遗传现象,是后天性的基因修饰过程,是基因对外界环境因素发生应答的重要机制,一般的规律是:甲基化可抑制基因的表达,而去甲基化则可表现出基因活跃表达。在一定的遗传易感性基础上,环境因素通过改变表观遗传信息如基因组甲基化模式而影响特定基因的表达,进而影响脑的发育,导致autism的发生。
　　那么,autism患者脑内是否存在Wnt信号通路及表观遗传修饰异常?Wnt信号通路活性变化与表观遗传机制异常是否存在联系?目前尚不清楚。针对这这些问题,本课题集中研究autism动物模型及培养神经元中Wnt/β-catenin通路相关基因的甲基化修饰及其与该通路活性变化的关系,以探讨autism发病的相关分子机制。我们主要进行了以下三方面的工作:
　　一、采用Wistar大鼠,在妊娠第12.5天时,腹腔注射(intraperitoneal injecting,ip)VPA制作子代autism大鼠模型,并运用热板致痛法、倾斜板实验、Morris水迷宫及Nissl染色等方法对模型大鼠进行行为和形态学检测。结果显示,与正常对照组比较,autism模型组大鼠脑发育异常、睁眼时间推迟、方向趋向性机能及伤害性知觉下降、游泳能力差、重复刻板动作增加、学习记忆和空间探索能力差。这些表现与人类autism患者的某些特征极为相似,表明用VPA注射法较成功地制作出了autism大鼠模型。
　　二、Wnt/β-catenin信号通路相关基因甲基化修饰的研究。运用甲基化特异性PCR(Methylation specific PCR,MSP)和硫转化DNA测序技术(Bisulfite DNA sequencing,BDS)检测VPA模型大鼠额叶皮层和海马脑区及培养神经元Wnt通路信号蛋白Wnt1、Wnt2、WIF-1及DKK1等相关基因启动区的甲基化修饰。MSP结果显示,在VPA模型大鼠额叶皮层和海马脑区及VPA处理培养神经元中,Wnt通路刺激性信号蛋白Wnt1和Wnt2基因启动子区去甲基化水平显著高于对照组(P＜0.001),Wnt通路抑制性信号蛋白WIF-1和DKK1基因启动子区去甲基化水平与对照组比较未见显著性差异(P＞0.05)。BDS结果显示,wnt1基因启动子区从-723到-328共395bp的片断所含26CpG双核苷酸中,VPAautism模型组大鼠额叶皮层和海马组织的去甲基化数目显著高于对照组(P＜0.01～0.001);wnt2基因启动子区从-400到-150共250bp的片断所含21CpG双核苷酸中,VPAautism模型组大鼠额叶皮层和海马组织的去甲基化数目显著高于对照组(P＜0.01),BDS与MSP的结果相一致。Western blot显示,VPA处理对重要表观遗传修饰因子DNMT3b(DNA methyltransferase 3b)的表达无影响。上述结果表明VPA处理具有诱导Wnt/β-catenin信号通路相关基因的去甲基化作用。
　　三、为揭示Wnt/β-catenin通路相关基因甲基化修饰对该通路活性的影响,应用实时定量PCR,Western blot及免疫荧光染色技术深入研究autism模型大鼠及原代培养神经元Wnt/β-catenin信号通路的活性变化,以及其对神经元生长的作用。实时定量PCR及Western blot结果显示,在VPA模型大鼠额叶皮层和海马脑区及VPA处理培养神经元中,wnt1和wnt2mRNA及蛋白表达显著高于对照组,并且与VPA剂量呈现正比关系,与启动子区甲基化水平呈现正相关关系(wnt1:R2=0.9621,P＜0.01;wnt2:R2=0.7805,P＜0.05)。免疫荧光组织化学、Western blot及实时定量PCR显示,Wnt/β-catenin通路效应分子β-catenin及其靶基因在VPA自闭模型组及神经元中含量升高,表明Wnt/β-catenin通路活性上调;VPA处理促进神经元生长,表现为突起数目和总长度显著高于对照组;而Wnt/β-catenin通路抑制剂能显著抑制VPA诱导的神经元生长。以上结果表明,Wnt/β-catenin通路相关基因甲基化修饰导致Wnt/β-catenin通路活性上调,VPA促进神经元生长可能由于该通路上调所致。
　　综上所述,我们的工作提示:环境因素(如VPA暴露)通过表观遗传效应诱导脑组织Wnt/β-catenin通路相关基因甲基化修饰改变,使脑内Wnt信号增强,引起神经元过快生长,患者脑组织体积增加,影响神经元正常发育和联系,阻碍了正常的神经网络形成,从而引起社会交往、情绪和语言等行为方面的异常,最终导致autism的发病。