APC基因表达和Wnt信号通路活性在精神分裂症小鼠模型PFC和VTA脑区中的变化及其意义

摘要

精神分裂症(schizophrenia，SZ)是遗传易感性、发育障碍和环境不利因素综合作用的结果，它的确切病因还不能准确地鉴定。近几年来的研究表明，可能与早期发育过程中，多条信号通路的易感基因的累加效应有关。其中，Wnt信号通路功能低下可导致SZ。Wnt信号通路与脊椎动物胚胎期模式发育、细胞生长、增殖有关。另外，Wnt信号通路在中脑形成和中脑多巴胺(Dopamine，DA)能神经元的增殖和分化起到重要作用。
　　有研究表明，成年神经发生和早期发育是相似的，也包括前体细胞的增殖、迁移、分化，最终形成与现存的神经元无差别的神经元。经典Wnt信号通路参与调节这一过程。这个过程受干扰，会出现脑神经功能异常的病症，如SZ。也有研究者发现SZ患者体内Wnt通路的负性调节基因腺瘤性结肠息肉病基因(AdenomatouspolyoosisColi，APC)mRNA的表达升高。
　　同时，SZ患者表现为一定的神经递质失调，例如谷氨酸功能低下，多巴胺能亢进。但神经递质失衡和Wnt信号低下在形成SZ过程中的关系仍未可知。我们推测，Wnt信号通路的异常改变，导致beta-连环蛋白(β-catenin)介导的核转录障碍，可能对神经递质的平衡，甚至相关受体的分布产生影响，这可能是Wnt信号低下产生SZ的原因之一。
　　为了论证Wnt信号通路对神经递质平衡和受体分布有调节作用，以探讨SZ的可能的分子发病机制，我们将研究分为三部分：
　　(1)SZ小鼠模型的建立。我们预设了一种神经递质的失衡状态，即谷氨酸功能低下的状态。通过用0.6mg/kg腹腔注射地卓西平(MK-801)处理小鼠造成谷氨酸功能低下而诱导出类似SZ的动物模型。用药一次制作急性模型。用药7d，每天一次，制作亚慢性模型。检验小鼠模型的典型的行为学表现：高运动状态、刻板性动作以明确小鼠模型的有效性。用0.9mg/kg抗精神病药物利培酮急性和亚慢性腹腔注射处理小鼠模型和正常小鼠作为对照研究。
　　(2)小鼠模型脑内Wnt信号通路活性和DA能神经元活性的检测①通过WesternBlotting(WB)和免疫组织化学(Immunohistochemistry，IFC)的方法检测该动物模型前额叶皮质(prefrontalcortex，PFC)和中脑腹侧被盖区(ventraltegmentalarea，VTA)脑区内Wnt信号通路的关键分子APC，糖原合成酶激酶-3beta(GSK-3β)和磷酸化的GSK-3β，β-catenin及磷酸化的β-catenin的含量和分布是否改变；②检测PFC和VTA脑区的另一种神经递质是否发生改变。考虑到DA与SZ的症状密切有关，故本研究通过WB和IFC的方法检测DA的合成限速酶酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase，TH)以判断DA能神经元的兴奋性；③通过RT-PCR，RealTimePCR的方法，在RNA水平检测Wnt信号通路分子的表达。考虑到Wnt信号通路可能存在与其他信号通路的交叉对话(crosstalk)，故检测磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/GSK-3(PI3K/Akt/GSK-3)通路的关键分子Akt的mRNA水平；④检测PFC和VTA脑区原代培养的神经元经MK-801和利培酮处理后，Wnt信号通路关键分子的表达改变；⑤选择利培酮0.9mg/kg亚慢性腹腔注射处理的正常小鼠作为对照组。实验结果进行t检验，以P<0.01作为差别有统计学意义的标准。
　　(3)亚慢性小鼠模型受体重塑检测和APC蛋白促进神经突起生长检测①通过RT-PCR、RealTimePCR的方法检测N-甲基-D-天(门)冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体2B亚单位(N-methyl-D-aspartatereceptor2Bsubtype，NR2B)在PFC和VTA脑区的表达是否出现改变；②通过IFC观测正常生长的SK-N-SH细胞和经过神经生长因子(nervegrowthfactor，NGF)刺激分化的PC12细胞中，APC蛋白的定位和分布；③检测APC蛋白在促进神经突起生长过程中所起的作用。构建APCsiRNA表达质粒，转染SK-N-SH和PC12细胞，观察APC蛋白含量变化及对细胞突起生长的影响。
　　主要实验结果及结论如下：
　　(1)MK-801诱导的SZ小鼠的行为学检测结果。以0.6mg/kg腹腔注射MK-801后，约15分钟后小鼠出现高运动状态，旷场跑动加快，伴有明显的刻板性动作，如10～20次/min的转圈，100～150次/min的不自主摆头，对环境的探究、警觉意识丧失。群体性活动丧失。用药后30min最明显，持续约90min。行为学检测结果表明：MK-801SZ小鼠模型具备SZ的阳性症状、阴性症状和认知缺陷的大部分。模型的稳定性和重复性好。
　　(2)SZ小鼠模型PFC和VTA脑区内Wnt通路关键分子表达的变化①WB结果显示：急性小鼠模型未见APC和其他Wnt通路组件的明显改变。在亚慢性小鼠模型脑的PFC和VTA脑区出现APC蛋白、磷酸化β-catenin蛋白和磷酸化GSK-3β的表达明显上调。IHC结果显示：亚慢性小鼠模型的PFC和VTA脑区APC蛋白免疫阳性增加；②WB方法显示：亚慢性小鼠模型PFC脑区TH蛋白的表达明显上升，VTA脑区的TH未见明显改变；③RT-PCR和RealTimePCR的检测表明：亚慢性小鼠模型PFC和VTA脑区.APC、β-catenin和GSK-3βmRNA表达水平明显上调，PFC区AktmRNA表达上调；④RT-PCR的方法检测到：在PFC和VTA脑区培养的原代神经细胞经0.6μg/mlMK-801处理后，β-cateninmRNA表达均上调；⑤WB的方法检测到：用利培酮亚慢性处理正常小鼠，引起PFC区和VTA区磷酸化β-catenin的表达上调，同时引起VTA脑区APC蛋白的下调表达。但对PFC区APC蛋白的表达无明显影响，对PFC和VTA区TH蛋白的表达无明显影响。另外，RT-PCR结果表明利培酮亚慢性处理引起小鼠PFC区AktmRNA的表达下降。以上结果提示：Wnt信号通路关键分子活性改变与SZ的发作有关。PFC脑区DA能活性增强可能是发病的重要环节。利培酮的抗精神病作用可能与Wnt信号通路关键分子活性调节有关。Wnt信号通路关键分子APC和β-catenin活性改变与Akt/GSK通路有关。
　　(3)亚慢性模型小鼠NMDA受体重塑检测和APC蛋白促进神经突起生长检测结果。①RT-PCR和RealTimePCR方法显示：亚慢性模型小鼠的PFC的组织NR2B的mRNA表达水平明显升高；②IFC方法显示：APC蛋白大量表达于SK-N-SH细胞胞体和类神经突起结构的顶端，而在类神经突起的干部(shaftsegments)较少存在；③APCsiRNA转染SK-N-SH和PC12细胞后，明显抑制细胞突起的延伸。本部分结果提示：NMDA受体重塑在亚慢性小鼠模型中是存在的。APC蛋白对于神经突起的延伸和重塑起到重要作用。