利用RNA干扰技术下调Lon基因表达的生物学效应研究

摘要

背景与目的: Lon是高度保守的ATP依赖蛋白酶，近期研究发现作为线粒体蛋白，它对细胞生长和增殖发挥重要调节作用。本文将肿瘤细胞内的Lon基因表达下调，观察肿瘤细胞的增殖及凋亡，以探讨Lon蛋白在真核细胞中的功能。 方法: 应用RT-PCR方法观察乳腺癌细胞MCF7、肺癌细胞NCI-H23等8种肿瘤细胞系和一种正常成纤维细胞系COS7细胞中Lon基因的表达情况。我们选用表达较为丰富的MCF7细胞株作为研究的靶细胞，设计针对Lon蛋白酶的小干扰RNA(siRNA)，构建pSilencer U6 2.1-Lon真核表达载体，用脂质体法转染人乳腺癌MCF7细胞，观察细胞形态学变化。并经G418筛选获得稳定转染的细胞后，收集转染后细胞总RNA和蛋白，利用RT-PCR和Western blot法检测Lon表达水平的变化；细胞计数法观察细胞的生长增殖能力；采用高温、紫外线照射、顺铂处理来诱导转染细胞发生应激反应，用噻唑蓝法(MTT法)检测细胞增殖活性的变化；流式细胞术检测siRNA诱导后的细胞周期和凋亡率。Caspase-3活性检测Lon下调介导的凋亡途径。 结果: Lon基因在8种肿瘤细胞系以及正常细胞系中均有表达。RT-PCR和Western blot显示重组质粒pSilencer U6 2.1-Lon转染的MCF7细胞，Lon mRNA和蛋白水平均明显降低；同时形态学观察发现凋亡细胞大量增加；细胞培养结果显示，细胞增殖能力明显减弱。紫外线照射和顺铂处理后的MTT结果显示pSilencer U6 2.1-Lon转染组的细胞，增殖能力明显下降，与空载体转染组相比有显著性差异(P<0.05)，空载体转染组与未转染组相比无显著性差异(P>0.05)。加热应激试验显示，41℃处理后，RNA干扰转染组(pSilencer U6 2.1-Lon)与空载体转染组(pSilencer U6 2.1)相比有显著性差异(P<0.05)；而在43℃、45℃，pSilencer U6 2.1-Lon转染组、空载体转染组和未转染组之间无显著性差异(P>0.05)。流式细胞术检测在细胞周期中，pSilencer U6 2.1-Lon组的细胞处于G0/G1期的细胞增多，同时S期的细胞比例减少，而另两组细胞无此改变；细胞凋亡率pSilencer U6 2.1-Lon质粒组为22.47％±3.15％，与空载体转染组2.3％±0.9％和无质粒转染组1.14％±0.79％比较有明显提高，而空载体转染组和无质粒转染组相比无明显差异；经顺铂处理后pSilencer U6 2.1-Lon质粒组的凋亡率较其他两组也具有显著统计学意义。Lon下调组的Caspase-3活性增加。 结论: RNAi能有效下调Lon蛋白的表达。Lon基因的下调可抑制乳腺癌细胞MCF7的增殖能力，诱导细胞凋亡，同时可增加MCF7对紫外线和顺铂处理的敏感性。本实验初步研究了Lon基因与肿瘤细胞发生、凋亡以及化放疗、热疗之间的关系，为进一步探索其机制奠定了基础。

目录

论文说明：英文缩略词

声明

前言

第一部分检测各肿瘤细胞中Lon基因的表达

材料和方法

结果

讨论

第二部分构建针对Lon基因的RNAi重组表达质粒

材料和方法

结果

讨论

第三部分MCF7细胞Lon基因下调后的生物学特性分析

材料和方法

结果

讨论

总结

文献综述 线粒体中Lon蛋白酶的研究进展

参考文献

附录

硕士期间发表的论文

致谢