利用RNA干扰技术下调血管瘤中VEGF基因的表达对血管瘤影响的实验研究

摘要

血管瘤是婴幼儿最常见的皮肤肿瘤，好发于头面部和四肢等体表部位，是以血管内皮细胞增生为主的良性肿瘤。其特点是在婴幼儿出生后第1年迅速增长，在随后的7-9年缓慢消退。一般将其分为增殖期、消退期和消退后期3个阶段。其中相当一部分血管瘤可以自然消退，不留下任何后遗症；还有部分血管瘤可能破溃感染留下瘢痕，大约20％血管瘤会破坏正常组织甚至危及生命。但是其发病机理和消退机制到目前还不清楚。因此血管瘤的治疗方法有很多，但是疗效却不确切。研究其发病机制不仅能够预防血管瘤的发生，同时也有助于临床的治疗。
　　目前研究发现，有助于血管生成的因子有：血管内皮细胞生长因子（VEGF）、雌二醇（oestradiol）、成纤维生长因子（FGF）、血管生长素（angiogenin）、转化生长因子（TGF）、α-肿瘤坏死因子（TNF-α）、血小板衍生生长因子（PDGF）、白介素-8（IL-8）等。其中VEGF被认为与血管瘤的生成、发展和消退有着重要的联系。VEGF具有促进血管化、维持内皮细胞的活性、促进内皮细胞的迁移、促进内皮细胞的增殖、增加微血管通透性等特性。它是内皮细胞（Endothelial cell，ECs）的特异性有丝分裂原，能选择性的作用于EC，促进其增殖、迁移，有利于血管生成。在肿瘤、缺血缺氧等情况下，VEGF及其受体呈高表达。而VEGF不足时会导致血管管腔闭合、血管退化。
　　目前利用基因干扰技术下调VEGF的表达在研究与治疗肿瘤方面取得了极大的进展。同时有学者发现增殖性血管瘤（婴幼儿血管瘤，IH）不同于其它类型的血管畸形，其早期迅速的扩张是血管内皮细胞的非控性增生，这些增生是血管形成刺激因子或抑制因子水平异常引起的。其中VEGF被认为在这种血管瘤的形成中起十分重要的作用。将VEGF作为一种新的治疗靶点，已部分应用到血管瘤的临床诊断和治疗中。
　　本课题拟利用基因干扰技术，通过体内和体外实验研究，下调血管瘤动物模型和婴幼儿血管瘤血管内皮细胞中VEGF基因的表达，观察血管瘤和血管瘤内皮细胞的发展变化，同时探讨血管瘤的增殖和消退机制。为进一步临床应用研究奠定理论基础。
　　1.裸鼠血管瘤移植模型的建立
　　目的：建立人毛细血管瘤裸鼠移植模型，探讨血管瘤裸鼠模型建立的最佳条件。
　　方法：将手术切除的雌激素受体阳性的儿童增生期血管瘤组织制成组织块，植入20只裸鼠(BALB/c nude mice)皮下，每只4处，将20只裸鼠分为4个实验组。实验1组在移植后给予普通鼠食喂养；实验2组在1组基础上每周肌注雌二醇0.01mg；实验3组在1组基础上每周肌注雌二醇0.1mg；实验4组在1组基础上每周肌注雌二醇1mg，于移植后第30、60、90天切取移植瘤。移植瘤标本进行病理学光镜检查，用血管内皮细胞单克隆抗体CD31、CD34、Ki-67行免疫组化染色。
　　结果：移植后早期各组标本内皮细胞大量变性、坏死，30d后，单纯喂养的实验1组及实验2组部分移植瘤开始吸收或形成脓肿及纤维化。实验3、4组移植瘤开始缓慢生长。90d后实验1组实验2组移植瘤均未成活，实验4组移植瘤部分成活，而实验3组移植瘤全部成活。光镜下成活的移植瘤与原血管瘤组织生物学特点相似。
　　结论：不同剂量的雌激素对血管瘤裸鼠移植模型的建立有一定影响，适量的应用雌激素可建立稳定的人血管瘤裸鼠移植动物模型。该模型可以应用到基础和临床的血管瘤研究。
　　2.增殖期血管瘤内皮细胞的培养和鉴定
　　目的：体外培养和鉴定血管瘤内皮细胞（Hemangioma endothelial cell，HemEC）。
　　方法：无菌条件下手术切取增生期血管瘤组织标本，利用组织块法进行培养。用含20％胎牛血清的M199培养基，加入内皮细胞生长支持物(Endothelial cell growth supplement，ECGS，浓度为100μg/ml）在含5％CO2、37℃培养箱中培养，每隔两到三天换液，细胞铺满瓶底后传代。用光学显微镜观察细胞形态和生长情况，并用免疫组织化学检测细胞表达Ⅷ因子相关抗原和透射电镜检测鉴定细胞。
　　结果：组织块接种3天后有细胞开始从边缘移出，细胞成多角形，1周左右混合成片，部分汇合成岛状。大约3周可以铺满瓶底，随后消化传代。传代细胞成典型的“鹅卵石”样排列铺满瓶底。细胞Ⅷ因子染色为阳性，透射电镜显示细胞质内含有ECs特征性的Weibel-Palade小体（W-P小体，呈点状或卵形）。
　　结论：利用组织块法可以获得纯度较高的血管瘤内皮细胞，该方法简单易用。
　　3.VEGF基因干扰质粒对血管瘤内皮细胞的影响
　　目的：应用人血管内皮生长因子(VEGF)干扰质粒，作用于体外培养的人增生期血管瘤内皮细胞，观察其对VEGF分泌及对血管瘤内皮细胞的影响。
　　方法：利用脂质体法将真核表达质粒pGCsi-U6NeoRFP-shVEGF转染到HemECs。采用倒置荧光显微镜观察质粒转染效果；用MTT法和酶联免疫吸附(ELISA)法分析观察shVEGF对HemECs的影响。
　　结果：转染组的HemECs与对照组相比，VEGF表达明显减少，转染组培养上清中的VEGF表达量在转染的第1、3、5、7天分别为141.3±7.82、92.34±5.71、68.07±5.95及40.65±6.71pg/ml于其它组比较P＜0.05，且VEGF质粒的转染使VEGF的表达下降也促进了细胞的凋亡。
　　结论：转染VEGF干扰质粒可以明显减少血管瘤内皮细胞VEGF的表达，同时也促进了细胞的凋亡。
　　4.VEGF干扰慢病毒对裸鼠血管瘤移植模型的影响
　　目的：制作VEGF慢病毒干扰载体Lenti-siRNA-VEGF，将其作用于裸鼠血管瘤移植模型，观察血管瘤的生长和凋亡的变化，探讨新的血管瘤防治方法。
　　方法：将VEGF干扰质粒包装成慢病毒载体的Lenti-siRNA-VEGF。制作裸鼠血管瘤移植模型，将Lenti-siRNA-VEGF作用于移植模型，大体观察瘤体变化，利用HE、免疫组化和TUNEL等方法观察瘤体切片。再用Western-blot方法从蛋白质水平探讨VEGF被沉默后血管瘤的生长和消退情况。
　　结果：实验组瘤体在注射后1周瘤体体积开始变小，1个月后瘤体缩小变硬；对照组无明显变化。HE检测可见管腔闭塞，瘤体纤维化。CD31、CD34免疫组化检测发现阳性细胞数分别为7.68±0.83、10.25±1.29（P＜0.05）。TUNEL检测发现细胞凋亡较对照组明显增多。Western-blot发现实验组VEGF蛋白表达明显下降。
　　结论：Lenti-siRNA-VEGF作用于移植模型可以明显降低瘤体VEGF的表达，促进瘤体内皮细胞凋亡。该方法为血管瘤进一步实验和临床研究提供一个新的方法。

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声明

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前 言

文献回顾

一、血管瘤的研究进展：

二、VEGF 及其受体与血管瘤的关系

三、血管瘤模型的

四、RNA 干扰技术

五、结论和设想

正 文

实验一 裸鼠血管瘤移植模型的建立

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

·4 讨论

实验二 增殖期血管瘤内皮细胞的培养和鉴定

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

附 图

实验三 VEGF基因干扰质粒对血管瘤内皮细胞的影响

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

实验四 慢病毒载体的VEGF RNAi对裸鼠血管瘤移植模型的影响

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

附 图

小 结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢