人胆囊组织比较蛋白质组学研究及相关蛋白功能验证

摘要

本研究以比较蛋白质组学研究思想为理论指导，选择胆固醇结石患者和正常人胆囊壁组织蛋白质为研究对象，应用2-DE及MALDI-TOF/TOF MS作为研究手段，预期可以发现一些新的在胆固醇结石形成中占重要作用蛋白质，通过相应的鉴定和生物学功能验证，为我们进一步深入揭示人类胆固醇结石形成的分子遗传机制及筛选特异性诊断标志物提供一定的理论基础与实验依据。
　　第一部分人胆囊全层组织蛋白质表达谱的建立
　　目的建立、优化胆固醇结石病人与正常人胆囊组织的蛋白质表达谱，用于胆囊组织的比较蛋白质组学研究，为探讨胆石成因提供实验依据。方法提取胆固醇结石患者和正常人胆囊壁组织总蛋白，构建相应的双向电泳蛋白质表达谱，应用ImageMaster图像分析软件获得差异蛋白点信息。结果胆固醇结石患者与正常人胆囊壁总蛋白浓度分别为7.45 mg/mL和4.36 mg/ml(P<0.01)。两组样本均获得分辨率高、重复性好的双向电泳图谱，胆固醇结石病人组与正常组内蛋白质平均匹配点数分别为632±61和606±64，各匹配率分别为73.46％和71.49％。组间蛋白质平均匹配点为474，匹配率为70.64％。胆固醇结石病人的27个蛋白点表达上调，8个点表达下调，与正常人间蛋白表达差异明显(P<0.05)。结论初步建立了胆固醇结石病人与正常人胆囊组织的差异蛋白质表达谱，分析两者间差异蛋白点，为胆石成因研究提供实验基础。
　　第二部分人胆囊浆膜下组织比较蛋白质组学研究
　　目的建立、优化人胆囊壁浆膜层组织的蛋白质表达谱和人胆囊壁浆膜下层组织的蛋白质组学研究技术平台，比较分析胆固醇结石患者与正常人胆囊壁浆膜下组织蛋白表达谱的差异，通过质谱技术筛选浆膜下层组织差异表达蛋白。方法提取胆固醇结石患者和正常人胆囊壁浆膜层和浆膜下组织总蛋白，构建相应的双向电泳蛋白质表达谱，应用ImageMaster图像分析软件获得差异蛋白点信息，质谱鉴定浆膜下层差异表达蛋白质。结果胆固醇结石病人与正常人的胆囊浆膜层和浆膜下层组织差异蛋白质表达谱均获得分辨率高、重复性好的双向电泳图谱，浆膜下层组织差异表达谱结果显示19个蛋白点在两者之间差异较大，质谱成功鉴定11个蛋白，1个重复。其中Tropomyosin4，Transgelin，Transthyretin，Cyanomet Rhb1.1，Haptoglobin-related protein precursor在结石组中表达上调，Myosin，Peroxiredoxin3，Hypothetical protein，T cell receptor alpha chain在结石组中表达下调。结论初步建立了胆固醇结石病人与正常人胆囊浆膜层与浆膜下层组织的差异蛋白质表达谱，对浆膜下层组织分析并成功鉴定差异蛋白点，为胆固醇结石形成的关键调控蛋白质研究提供实验依据。
　　第三部分差异表达蛋白质的再验证
　　目的对浆膜下层组织比较蛋白质组学筛选出的差异表达蛋白质进行再验证，以保证初筛结果的可信度及进一步功能学研究的确定性。方法通过Western Blotting和RT-PCR技术验证TTR、SM22-alpha、TPM4、Prx3这4种差异表达蛋白在胆固醇结石患者和正常人的胆囊组织中的表达情况。结果Western Blotting证实TTR、SM22-alpha、TPM4在胆固醇结石患者胆囊壁中较正常对照组上调，RT-PCR证实SM22-alpha在结石组中表达上调，Prx3则表达下调。结论 Western Blotting和 RT-PCR对差异表达蛋白质的再验证结果表明我们使用的2-DE、ImageMaster2D Platinum5.0 software分析、质谱鉴定等比较蛋白质组学研究技术平台的准确性、稳定性和结果可靠性。
　　第四部分运甲状腺素蛋白促成核功能的初步研究
　　目的观测TTR在体外模拟胆汁体系中的成核活性。方法构建Small和综合模拟胆汁体系，运用Holan观测成核时间法，探讨TTR的促成核效应。结果 TTR组的成核时间在Small模拟胆汁体系中平均为(14.5±1.29)d，综合模拟胆汁体系中平均为(13.5±0.58)d，TTR可以促进胆固醇结石成核、结晶。结论在体外模拟胆汁体系中TTR具有促成核活性，为进一步研究其在胆固醇结石发病机制中的作用提供一定的实验依据。
　　综上所述，本课题通过比较蛋白质组学技术建立了胆固醇结石组和正常对照组的胆囊组织、浆膜层组织、浆膜下层组织的蛋白质表达谱，对浆膜下层组织筛选、成功鉴定出差异蛋白质点11个，重复1个，运用蛋白质免疫印迹技术和RT-PCR方法进行了TTR、SM22-alpha、TPM4、Prx3四种差异表达蛋白的再验证，并对其中的TTR与胆固醇结石形成的关系进行了初步的研究。