人子宫内膜癌比较蛋白质组学研究及癌相关蛋白Cyclophilin A的表达与功能验证

摘要

目的：蛋白质组学方法可高通量、整体性的反映组织或细胞内蛋白质水平的变化，已成为目前研究癌症发病机制、筛选肿瘤标记物、寻找药物作用和基因干预靶点等的有力手段。本研究拟采用双向电泳分离子宫内膜癌与正常子宫内膜组织的总蛋白质，建立双向电泳图谱，寻找表达差异点，通过质谱分析鉴定出癌相关蛋白候选分子。应用RT-PCR、westem Blot和免疫组化等方法在mRNA和蛋白质水平对其表达差异进行验证，并分析与子宫内膜癌组织学分级、手术．病理分期等的关联性。应用RNA干扰技术对该基因在细胞增殖、凋亡等方面的生物学功能进行初步的探讨。以期通过此研究，为进一步揭示子宫内膜癌发病机制，寻找有意义的肿瘤标记物及基因干预的靶点，提供新的线索和思路。 方法：取8例子宫内膜样腺癌和8例增生期正常子宫内膜组织标本，配对分为8组。提取组织总蛋白，通过双向电泳技术分离总蛋白，并得到8组双向电泳凝胶图谱。通过PDQuest7.1.1软件对图像进行裁剪、斑点检测和匹配分析，评价图像的匹配率，并检测出表达差异点。将差异点切下后进行胶上原位酶解，然后通过基质辅助激光解吸电离四极杆飞行时间质谱(MALDI-Q-TOF MS/MS)及蛋白质数据库检索进行蛋白质鉴定。在鉴定出的差异点中选择表达恒定，差异明显且稳定，质谱结果理想可靠的蛋白作为子宫内膜癌相关蛋白候选分子。采用RT-PCR和Western Blot方法对候选分子在子宫内膜癌与正常子宫内膜组织间的表达差异在mRNA和蛋白水平进行验证。应用免疫组化方法检测该蛋白在52例子宫内膜样腺癌和39例增生期正常子宫内膜、16例宫颈癌和10例正常宫颈上皮组织石蜡标本中的表达，对结果进行半定量打分和Imagepro.Plus5.0软件测定IOD值，应用统计学方法对其在癌与正常组织间的表达差异性和与组织学分级、手术-病理分期的关联性进行分析。应用RNA干扰技术，将针对靶基因的siRNA以脂质体Lipofectamine2000为载体转染人子宫内膜癌HEC-1-B细胞，抑制靶基因RNA表达水平，通过MTT、流式细胞术、细胞克隆形成实验等方法检测细胞增殖、凋亡，细胞周期等情况，对该基因的生物学功能进行初步的探讨。 结果：得到8组分辨率高，重复性好的人子宫内膜癌与正常子宫内膜的双向电泳图谱，检测的平均斑点数分别为782±28和760±33，各组内两张胶的匹配率(％)平均为85.625±4.2。共筛选出112个差异点，其中60个在癌组织中上调，52个下调。经质谱分析和数据库检索成功鉴定出99个蛋白，质谱分析成功率达88.4％，其中21个蛋白质谱结果理想，胶上差异明显，重复次数在4次以上。对鉴定出的差异蛋白进行了功能和细胞定位的分析和归类，并确定cyclophilin A为子宫内膜癌相关蛋白候选分子。RT-PCR结果显示癌组织中cyclophilinA基因与其受体CD147基因表达分别为正常组织的2.49倍(P<0.01)和3.69倍(P<0.01)。Western Blot结果显示癌组织中cyclophilinA蛋白表达为正常组织的2.55倍(P<0.01)，具有显著性差异，与蛋白质组学结果一致。免疫组化结果显示该蛋白主要表达于胞浆及部分胞核。半定量积分法及图像分析法显示子宫内膜癌组织表达显著高于正常组织(P<0.01)；并且表达与组织病理学分级具有关联性，随组织分化程度降低，表达升高(P<0.01)；与手术.病理分期无关联性(P>0.05)。宫颈癌组织表达高于正常宫颈组织，同样具有显著性差异(P<0.01)。cyclophilin A-siRNA转染HEC-1-B细胞可显著抑制靶基因表达，抑制率达60％以上。转染后细胞增殖活性显著下降，并随浓度增加和时间延长而增加。100nM抑制效应最强，转染后72小时抑制率可达52.4％(P<0.01)。克隆形成实验显示培养14天后转染细胞克隆形成数目、克隆形成率等显著低于未转染细胞(P<0.01)。转染后细胞凋亡率显著增加，72小时凋亡率(％)达45.7±3.1(P<0.01)，并伴有G<,0>/G<,1>期比例升高，S期比例下降等细胞周期变化。 结论：本研究采用蛋白质组学技术得到了子宫内膜癌与正常子宫内膜组织的蛋白表达图谱，筛选出112个表达差异点，并鉴定出其中99个蛋白，确定cyclophilin A为子宫内膜癌相关蛋白候选分子。通过RT-PCR、Western Blot和免疫组化等方法验证了该蛋白在癌与正常组织的表达具有显著性差异，并认为与组织病理学分级具有关联性，与手术-病理分期无关联性；对宫颈癌组织的检测也得到类似结果。通过RNA干扰抑制cyclophilin A基因的表达，显示该蛋白具有与促进增殖，抑制凋亡相关的生物学功能。本研究显示cyclophilin A有望成为子宫内膜癌早期诊断的肿瘤标记物及潜在的药物治疗或基因干预靶点。

目录

论文说明：英文缩略词表

声明

前言

材料和方法

结果

图表一

图表二

讨论

结论

参考文献

综述一：Cyclophilin A蛋白生物学活性及疾病相关研究进展

综述二：从蛋白质到临床-蛋白质组学新技术在肿瘤研究中的应用

附件

致谢