骨髓增生异常综合征向急性白血病转化相关基因的筛选及TUBB基因的初步研究

摘要

第一部分成人原发MDS患者巢式病例对照研究队列的建立及转白危险因素的研究
　　目的:建立成人原发MDS患者巢式病例对照研究队列,对该队列中MDS患者的临床特点、WHO分型和转白危险因素进行研究,旨在进一步分析我国MDS患者的临床特征和转白危险因素。
　　方法:采用前瞻性方法收集连续性样本,对上海市中美联合白血病协作组24家医院提供的病例进行细胞形态学、流式细胞术免疫分型、细胞遗传学(包括染色体G显带和荧光原位杂交技术)及骨髓病理检查,采用WHO标准进行诊断和分型,并进行严密随访。白血病转化累积风险率用Kaplan-Meier方法计算。Log-rank时序检验用于MDS转白的单因素分析。用COX回归模型进行MDS转白的多因素分析。
　　结果:经上述综合诊断方法,共有435例患者诊断为MDS。截至到2008年12月30日,该队列全部患者中,383例(88％)获得随访,52例失访(12％)。中位随访时间20.3(4.2～57.1)月。该队列中共有41例转化为急性白血病(病例组),342例未转化为急性白血病(对照组)。该队列患者的中位发病年龄为58(18～90)岁,男女比例为1.33:1。RCMD病例所占比例最高(65.5％),而RA(2.3％)、RARS(1.1％)和5q-综合征(0.5％)所占比例较低。染色体异常率为38.7％,以+8最多见,占所有病例的16.7％(71例)。41例MDS转白患者中位转白时间为4(1～25)个月。单因素分析结果表明年龄(P=0.028)、性别(P=0.018)、白细胞计数(P=0.006)、中性粒细胞绝对值(P=0.029)、WHO分型(P=0.000)、骨髓原始细胞比例(P=0.000)、IPSS染色体危险分组(P=0.000)以及IPSS预后分组(P=0.000)共8个变量与MDS转白相关。COX回归模型多因素分析结果确定年龄(P=0.002)、性别(P=0.000)、WHO分型(P=0.000)、IPSS染色体分组(P=0.045)和骨髓原始细胞比例(P=0.048)为MDS转白的危险因素。
　　结论:我们采用巢式病例对照研究的方法,首次建立了我国435例成人原发MDS患者的研究队列。我国MDS患者的临床特点和WHO亚型分布均与西方国家存在不同,其机制有待进一步阐明,我们考虑可能与人种、地域、环境差异有关。经COX回归分析,确定年龄、性别、WHO分型、IPSS染色体分组和骨髓原始细胞比例为本研究中MDS转白的危险因素。
　　第二部分MDS转白相关基因筛选的巢式病例对照研究
　　目的:筛选MDS向急性白血病转化(简称转白)的相关基因,以期发现可以预测MDS转白的特异性分子标志。
　　方法:采用巢式病例对照研究与全基因组表达谱芯片相结合的方法,通过对第一部分研究已建立的MDS患者巢式病例对照研究队列中同一个体MDS患者初诊时和转白时的全基因组表达谱芯片检测,分析比较在转白过程中表达发生变化的基因(芯片自身对照研究)。根据第一部分研究所得出的转白危险因素对MDS患者巢式病例对照研究队列中病例组(发生转白患者)和对照组(未发生转白患者)进行配对。通过对转白危险因素配对的病例组和对照组患者初诊时的全基因组表达谱芯片检测,分析比较在转白患者与未转白患者之间基因表达的差异(芯片病例对照研究)。综合这两方面的结果,通过生物信息学分析方法,最终筛选出MDS转白的相关基因。
　　结果:根据转白危险因素的配对条件,我们最终从己建立的MDS巢式病例对照队列中挑出3例病例组患者和3例对照组患者进行全基因组表达谱芯片检测。病例组患者初诊时的芯片检测结果设定为病例组,病例组患者转白时的芯片检测结果设定为转白组,对照组患者初诊时的芯片检测结果设定为对照组。以差异倍数＞2倍作为入选差异基因的条件。自身对照研究的芯片结果(病例组和转白组芯片结果分析)表明,共获得65条差异表达基因,其中下调基因20条,上调基因45条。病例对照研究的芯片结果(病例组和对照组芯片结果分析)表明,共获得435条差异表达基因,其中191条下调基因,244条上调基因。综合自身对照研究和病例对照研究这两方面的芯片结果进行差异基因筛选,发现958条差异表达基因(差异表达基因定义为在病例组、转白组、对照组这3组之间至少有一组倍数大于2倍的基因)。用t检验对病例组和对照组的基因进行检验,取P＜0.05的基因作为病例组和对照组的区分基因。最终筛选出由6条基因组成的基因子集,这6条基因按差异显著程度依次为TUBB、PSMD1、SLC7A5、ATG3、TUBB2C和TIMM10。
　　结论:采用巢式病例对照研究和全基因组表达谱芯片技术相结合的方法,经芯片自身对照研究和转白危险因素配对的芯片病例对照研究,通过生物信息学分析,最终筛选出6条MDS转白的相关基因。这6条基因可能在MDS转白中发挥了重要的作用。
　　第三部分MDS患者TUBB基因表达的临床研究
　　目的:探讨在MDS患者巢式病例对照研究队列中,发生转白MDS患者初诊时和未发生转白MDS患者初诊时TUBB基因mRNA表达水平是否存在差异。
　　方法:基于第一部分研究已建立的MDS患者巢式病例对照研究队列,采用病例:对照=1:1配对方法,从该队列病例组(发生转白MDS)和对照组(未发生转白MDS)中随机抽出符合转白危险因素配对条件的检测对象。采用实时荧光定量PCR(Realtime PCR)方法,检测该队列中病例组(发生转白MDS患者)初诊时和对照组(未发生转白MDS患者)初诊时TUBB基因mRNA表达水平。
　　结果:我们从病例组和对照组中各抽出符合转白危险因素配对条件的11例患者。Realtime PCR检测结果表明TUBB基因的表达水平在病例组11例患者中与对照组相比呈显著增高(P＜0.01)。
　　结论:TUBB基因mRNA表达水平在MDS患者巢式病例对照研究队列的病例组(发生转白MDS)和对照组(未发生转白MDS)患者中存在明显差异,提示TUBB基因可能是MDS转白的相关基因。
　　第四部分TUBB基因在MDS转白细胞株中表达沉默的实验研究
　　目的:观察TUBB基因沉默前后:MDS转白细胞株生物学特性的变化,初步探讨TUBB基因可能在MDS转白中所发挥的作用。
　　方法:采用脂质体转染方法,在MDS转白细胞株(SKM-1细胞株)中转染TUBB特异性siRNA。TUBB特异性siRNA采用化学合成法制备。观察TUBB基因沉默前后SKM-1细胞株的生长曲线、细胞周期、软琼脂培养集落形成能力以及细胞超微结构的变化。
　　结果:转染TUBB特异性siRNA24小时,Realtime PCR检测结果表明,转染组TUBB基因mRNA表达水平较未转染组显著下降(P＜0.05)。转染TUBB特异性siRNA沉默TUBB基因后,SKM-1细胞增殖明显受抑(P＜0.05)。未转染的SKM-1细胞与TUBB-siRNA转染后的SKM-1细胞相比,S期细胞比例高,而G0/G1期比例下调,提示TUBB-siRNA主要作用于G1/S限制点,从而将SKM-1阻滞于G0/G1。但对G2/M期的影响较小。软琼脂克隆形成实验表明,转染后的SKM-1细胞形成的细胞克隆数显著少于未转染的SKM-1细胞(P＜0.01)。透射电镜结果提示,未转染组SKM-1细胞呈现典型的肿瘤细胞透射电镜下表现:核浆比例减小,核仁大而明显,常为多个核仁。转染TUBB特异性siRNA后,SKM-1细胞出现细胞浆空泡,核碎裂的改变。
　　结论:转染TUBB特异性siRNA后,SKM-1细胞株出现增殖受抑、S期细胞比例明显降低、软琼脂克隆形成能力明显受抑,提示TUBB基因可能通过影响MDS恶性克隆的增殖途径在MDS转白过程中起作用。