人巨细胞病毒M抗原表位的筛选与初步应用研究

摘要

人巨细胞病毒属β疱疹病毒亚科，它在人群中感染非常普遍。在成年的健康人群中HCMV的感染呈现不显性临床症状，但对于免疫抑制人群能造成严重疾病，甚至导致生命的危险。目前HCMV临床检测手段并不完善，也没有一种有效的疫苗能够预防病毒的感染。 本实验以噬菌体展示技术为手段，以标准羊抗HCMV多抗为靶标，通过正常山羊IgG抗体消减筛选到一个gM抗原表位CMVMME，核心序列为Ⅹ-ⅩⅩⅩⅩ(由于专利问题序列未公开)。经计算机分析及Blast搜索，CMVMME与gM蛋白某一肽段高度同源；Western Blot方法证实鼠抗CMVMME抗体不仅能够特异结合HCMV病毒粒子，也能特异结合重组表达的gM多肽。表明CMVMME是gM的一个线性表位。 为初步研究单氨基酸突变对CMVMME结合抗体活性的影响，将CMVMME中的关键氨基酸人工单突变为甘氨酸，ELISA和western Blot结果发现将谷氨酰胺突变为甘氨酸后，CMVMME结合HCMV多抗的活性明显下降，而其它氨基酸单突变后CMVMME活性未见明显变化。提示单氨基酸突变时谷氨酰胺残基影响着CMVMME特异结合HCMV多抗的活性。 为证实鼠抗CMVMME多抗具有中和抗体性质，通过病毒中和实验，分别用50 μg标准HCMV多抗B65275G、鼠抗CMVMME抗体、正常小鼠抗体和正常山羊抗体处理50TCID<,50>HCMV病毒，发现用鼠抗CMVMME抗体处理后的病毒的感染能力大大降低；用FITC标记病毒即刻早期蛋白表达的方法发现分子量为68KD的病毒即刻早期蛋白在细胞内的表达数量明显减少。标准羊抗HCMV多抗B65275G几乎完全抑制了病毒的侵入，而正常小鼠抗体和正常山羊抗体处理的病毒与不加任何抗体处理的病毒感染能力无明显变化，表明鼠抗CMVMME多抗是一种具有中和作用的抗体，它能在一定程度上阻断HCMV对细胞的侵袭。 为了验证CMVMME与HCMV感染的人血清之间的特异性结合反应，首先采用两个不同生物公司生产的HCMV IgG ELISA检测试剂盒分别与40份人血清反应，发现有8份血清均为HCMV IgG阳性。在这8份IgG阳性人血清中，重组表达的已知的gB抗原表位区ADl能够与5份血清反应，AD2能够与6份血清反应，CMVMME能够与3份血清发生特异性结合反应。将AD1、AD2和CMVMME混合则有7份血清与之反应，表明三种抗原与HCMV抗体反应具有一定的互补性。 本研究在HCMV诊断和预防研究上进行了摸索和探讨，取得了一定的结果，这将为进一步研究诊断和预防HCMV的试剂打下良好的基础。

目录

论文说明：缩略语

声明

摘要

前 言

第一部分HCMVM抗原表位的筛选与鉴定

1HCMVM抗原表位的筛选

1.1实验材料

1.2实验方法

1.3实验结果

2HCMVM抗原表位的鉴定

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3实验结果

3HCMVM抗原表位的定位

3.1实验材料

3.2实验方法

3.3实验结果

4讨论

第二部分HCMVM抗原表位单氨基酸突变研究

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨 论

第三部分HCMVM抗原表位肽试验疫苗的初步研究

1抗HCMV M抗原表位多抗中和病毒实验

1.1实验材料

1.2实验方法

1.3实验结果

2人巨细胞病毒M抗原表位在细菌鞭毛上的展示及动物免疫

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3实验结果

3讨论

第四部分HCMV M抗原表位作为诊断试剂的初步应用研究

1HCMV gB抗原表位基因片断克隆、表达及活性检测

1.1实验材料

1.2实验方法

1.3实验结果

2HCMV抗原表位与感染HCMV的人血清之间的特异结合反应

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3实验结果

3讨论

结论

参考文献

致 谢

附录

发表论文一

发表论文二