MiR-223抑制IGF-1R及下游的信号通路负向调控Hela细胞的生长

摘要

microRNA-223(以下简称miR-223)于2003年最早通过生物信息学方法发现表达于血液细胞，如粒细胞，单核细胞及白血病细胞，能够促进白血病细胞向粒细胞分化与成熟。维甲酸诱导白血病分化的重要机制之一就是诱导miRNA-223的表达。因此miR-223成为白血病的治疗过程中的一个非常重要的分子。miR-223的启动子区域存在多个转录因子结合位点，包括PU.1，C/EBP，GATA，NF-1A，E2F1等能够抑制或促进miR-223的转录。MiR-223诱导白血病粒细胞分化的分子机制之一是通过直接抑制靶基因(Targets)肌细胞增强因子(myocyte enhancer factor Mef2C)，Mef2C在粒细胞分化过程中能够促进粒细胞的生长与增殖。也有研究发现miR-223能够促进粒细胞的分化，其机制是直接抑制另一个靶基因核因子1A(Nuclear Factor NF-1A)。减少NF-1A在miR-223启动子区域对C/EBPα的竞争结合。C/EBPα一方面能够解除白血病AML过程中的融合蛋白PML-RAR对粒细胞分化的阻滞，另一方面能够结合到miR-223启动子区域诱导miR-223的表达。在血液系统外，肝癌患者中发现miR-223的表达受到了抑制，miR-223的另一个直接靶基因STMN1的蛋白水平则出现与miR-223表达相反的变化。但是miR-223在诱导白血病细胞分化过程中的作用机制并不十分清楚，是造血细胞分化的机制分子，还是分化以后的表型分子？在血液系统之外，miR-223是否也具有类似的作用？单一靶基因对整个细胞生物学功能的影响有多大？多个靶基因之间是否会有影响？本实验就是要探讨在血液系统外miR-223的功能及作用机制。研究共分两部分。
　　第一部分:构建miR-223过表达的HeLa细胞并检测其功能学的变化
　　由于慢病毒载体可以将携带的ShRNA/miRNA融合到基因组并持续表达，我们实验中用慢病毒载体PLL3.7我们构建了miR-223过表达的载体。通过感染miR-223低表达的人宫颈癌细胞HeLa细胞，并用流式细胞仪筛选成相当于稳定转染的miR-223过表达的HeLa细胞株。通过microRNA特异的茎环引物介导的RT-PCR和Real-timePCR检测发现，miR-223在HeLa中过表达。过表达miR-223的HeLa细胞(以下标记为HeLa-miR-223)和其空载体对照(以下标记为HeLa-EV)相比，体外的细胞增殖能力，集落形成能力和迁移能力都受到明显的抑制;体内实验表明，HeLa-miR-223在裸鼠体内能明显抑制裸鼠体内肿瘤的重量。说明miR-223能够在血液系统外抑制肿瘤的生长。
　　第二部分:miR-223抑制HeLa细胞生长的机制探讨
　　为了探讨miR-223在体内体外抑制HeLa细胞生长的机制，我们首先通过生物信息学方法筛选了miR-223可能的靶基因，并将其3'UTR构建到含双荧光素酶报告基因(Dual-LuciferaseReportGene)的psi-CHECK-2载体，观察相关荧光素酶比例的变化情况。并结合mRNA和蛋白水平的变化，确定了IGF-1R、FoxO1、FoxO3和Rasa1是miR-223靶基因。实验结果表明:IGF-1R的双荧光素酶在转染miR-223R后R2/R1比值明显降低，降低的结果可以被miR-223抑制剂所逆转。IGF-1R的mRNA水平，蛋白水平均明显低于HeLa-EV组。IGF-1R所介导的下游信号通路PI3K/AKT/mTOR/p70S6K信号通路活性受到明显的抑制。表现为蛋白激酶AKT的磷酸化(p-AKT)的水平受到明显抑制，但总的AKT水平未受明显影响。GSK3β，P27是AKT下游的两个分子，被AKT直接抑制。HeLa-miR-223组这两个分子的蛋白水平明显升高。被AKT促进的Bcl-2，mTOR下游的重要激酶p70S6K以及p70S6K下游的缺氧诱导因子(Hypoxia-InducibleFactor-1αHIF-1α)的蛋白水平则明显降低。说明miR-223抑制HeLa生长是通过IGF-1R信号通路起作用的。在HeLa细胞中干扰IGF-1R可以模拟miR-223抑制HeLa生长的情况，而HeLa-miR-223组的挽救(Rescue)实验则可以逆转HeLa细胞受抑制的状态。miR-223也可以作用于FoxO1FoxO3和Rasa1，这三个基因都是抑癌基因，但并未引起细胞增殖的加快。说明同一个microRNA的不同靶分子之间存在相互调节关系。
　　综上所述，miR-223通过抑制靶分子IGF-1R及其介导的信号通路抑制HeLa细胞的生长，另外FoxO1FoxO3和Rasa1的信号调节也参与了HeLa细胞增殖的调节。

目录

中英文缩略词对照表

摘要

前言

参考文献

第一部分 慢病毒介导的miR-223包装及功能实验

引言

材料与方法

1．材料

2．方法

3．结果

讨论

小结

参考文献

第二部分miR-223抑制靶基因IGF-1R及下游的AKT／mTOR信号通路抑制HeLa细胞生长

引言

材料与方法

1． 材料

2． 方法

3 结果

讨论

小结

全文总结

参考文献

MicroRNA在肿瘤中的研究进展

博士期间发表论文

致谢

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