免疫性血小板减少性紫癜患者外周血CD4+T细胞亚群数量及功能研究

摘要

研究背景:免疫性血小板减少性紫癜(Immune Thrombocytopenic purpura, ITP)是一种获得性器官特异性自身免疫性疾病。患者体内产生抗血小板自身抗体，导致网状内皮系统破坏吞噬血小板，从而引起血小板减少。依据ITP发病持续时间，可以分为新诊断的，持续性和慢性ITP。自上世纪50年代以来，研究人员对ITP的发病机制进行了大量的研究。特别是近年来随着免疫学的发展，人们对其发病机理的认识有了很大的提高，经典机制认为ITP的发病是由自身抗体介导的，但细胞免疫在ITP发病中亦起着重要作用。对于ITP患者T细胞的异常已有报道，包括血小板特异的自身反应性T细胞的活化，增强的针对血小板的细胞毒作用，调节性T细胞的缺失等。本文探讨ITP患者中T辅助细胞CD4+(helper T cell，Th)细胞免疫状态以及其与治疗反应的关系，检测ITP患者CD4+细胞中Th1/Th2/Th17/Treg细胞亚群的比例及其分泌的细胞因子情况，并研究它们随疾病不同状态的变化，进一步清楚了解T细胞在ITP发病中的作用，为ITP患者的治疗提供新的理论依据。蛋白芯片是一种高通量监测系统，通过靶分子和捕捉分子相互作用来监测蛋白分子之间的相互作用。蛋白芯片能够同时检测多种细胞因子，有助于阐明细胞因子在ITP发病中的作用，为靶向治疗提供理论依据。
　　目的:检测ITP患者糖皮质激素治疗前后体内CD4+细胞比例以及CD4+细胞Th1/Th2/Th17/Treg细胞亚群相关细胞因子及其转录因子的表达，研究ITP患者CD4+细胞亚群分布特点及与临床的关系。
　　检测ITP患者外周血中40种与CD4+细胞相关的细胞因子的变化，旨在利用蛋白芯片技术观察这40种细胞因子在疾病的不同时期的表达，了解与ITP疾病状态相关的细胞因子。
　　方法:应用流式细胞计数方法检测ITP患者外周血CD4+细胞百分率、CD8+细胞百分率、CD4+/CD8+细胞比值，并分析它们与ITP患者外周血血小板的相关性。应用流式细胞计数方法检测实时荧光定量RT-PCR方法检测了20例初发ITP患者（男性8例，女性12例，中位年龄41.0yrs）外周血单个核细胞CD4+细胞Th1/Th2/Th17/Treg细胞亚群相关细胞因子及转录因子T-bet, IFN-γ，GATA-3，TGF-β，Foxp3，IL-2，IL-4等的表达，并检测了患者接受糖皮质激素治疗后以及20例正常对照者外周血单个核细胞中T-bet，IFN-γ，GATA-3，TGF-β，Foxp3，IL-2，IL-4基因表达水平。
　　同时应用RayBio(R)Human Inflammation Antibody Array3细胞因子抗体芯片盒检测ITP患者的外周血中40种细胞因子变化。蛋白芯片技术检测了30例初发患者、30例完全缓解患者的血浆中Th1/Th2/Th17/Treg细胞相关的40种细胞因子蛋白的表达情况，并分析这些细胞因子与患者病情的相关性。
　　结果:实时荧光检测中所有ITP患者均能完成糖皮质激素治疗，未发生明显治疗不良反应，治疗前血小板计数为(17.6±13.8)×109/L，治疗后血小板计数达到(123.8±52.8)×109/L，其中12例取得完全缓解（血小板计数≥100×109/L），7例取得部分缓解（血小板计数≥50×109/L），1例治疗后血小板计数仅达到45×109/L，但出血症状明显改善。治疗前患者外周血单个核细胞中T-bet、IFN-γ、IL-2表达均较正常对照明显升高，差异有显著统计学意义(p＜0.01);治疗后Foxp3表达较治疗前升高(p＜0.05)，T-bet、IFN-γ、IL-2、IL-4表达均较治疗前降低(p＜0.05)，其中IL-2表达仍较正常对照升高(p＜0.01)。
　　Th1细胞相关基因(T-bet、IFN-γ、IL-2)中，T-bet、IFN-γ在各亚组中治疗后表达水平均较治疗前降低(p＜0.05)，IL-2在各亚组中治疗后表达水平亦较治疗前降低，但在治疗前血小板计数≤10×109/L及治疗后血小板计数≤100×109/L患者中治疗前后差异无统计学意义。Th2细胞相关基因（GATA-3、IL-4）在各亚组中治疗前后差异均无统计学意义。Treg细胞相关基因(Foxp3、TGF-β)中，Foxp3在治疗前血小板计数≤10×109/L患者中治疗后表达水平较治疗前明显升高(p＜0.05); TGF-β在老年患者与年轻患者中呈现截然相反的变化模式，其在年龄＜60yrs患者中治疗后表达水平较治疗前降低(p＜0.05)，而在年龄≥60yrs患者中治疗后表达水平较治疗前升高(p＞0.05)。
　　细胞因子蛋白芯片实验发现，与正常健康人相比，初发ITP患者升高2倍以上的细胞因子有:EOTAXIN，EOTAXIN-2，GM-CSF, G-CSF, IFN-γ，IL-1β，IL-2，IL-4, IL-6, IL-7, IL-11, IL-12p40, IP-10, MCP-1, M-CSF, RANTES, PDGF-B;而细胞因子Ⅰ-309, IL-1α, IL-3, IL-6sR,IL-8,IL-10,IL-12p70,IL-13,IL-15,IL-16, MIG, MIP-1α, MIP-1β, MIP-1δ, TGF-β1, TNF-α, TNF-β, sTNFRI,TIMP-2与正常对照组相比变化在2倍以内;降低2倍以上的细胞因子有ICAM-1, IL-17,s TNFRⅡ, MCP-2。
　　ITP患者缓解时，EOTAXIN，EOTAXIN-2，IFN-γ，IL-1β，IL-2，IL-6，IL-11，IL-12p40，IL-7，IP-10，MCP-1这些在患者初发时升高2倍以上的因子恢复到正常水平，与正常组相比变化在2倍以内。缓解时仍然升高2倍以上的细胞因子有:RANTES，G-CSF, PDGF-B，GM-CSF, M-CSF, IL-4，而ICAM-1，IL-8在初发时未见升高而缓解时升高2倍。
　　结论:ITP患者存在Th细胞功能异常，Th1/Th2/Th17/Treg细胞亚群的比例失衡。糖皮质激素治疗仍是针对初治ITP患者的有效治疗手段，其作用机制可能与抑制Th1、Th2细胞亚群（以Th1细胞亚群为主）以及诱导Treg细胞亚群有关。Th细胞免疫状态监测可能成为ITP患者疗效评估与预后评价提供思路。蛋白芯片能以极小的样本量检测高通量的细胞因子，是筛选ITP相关的细胞因子的比较理想的技术方法。

目录

前言

摘要

主要试剂及仪器

第一部分 ITP患者外周血T细胞亚群变化的研究

一、前言

二、材料和方法

三、结果

四 讨论

第二部分：ITP患者CD4+T细胞细胞因子及其转录因子mRNA表达水平的研究

一、前言

二、材料和方法

三、结果

四、讨论

第三部分：ITP患者CD4+T细胞细胞因子蛋白水平的研究

一、前言

二、材料和方法

三、结果

四、讨论

英文缩写对照表

参考文献

致谢

CD4+T细胞亚群及其生物学特性

糖皮质激素治疗对ITP患者T辅助细胞相关细胞因子基因表达的影响

声明