南方红豆杉产紫杉烷类化合物内生真菌的分离与遗传转化研究

摘要

紫杉醇是一种二萜类的生物碱，最初从太平洋短叶红豆杉(Taxus brevifoliaNutt.)的树皮中分离到，研究发现紫杉醇对包括卵巢癌在内的多种癌症具有良好疗效。由于紫杉醇在树皮中含量很低并且提取过程繁琐，因而价格昂贵，很大程度上限制了紫杉醇的应用。随着紫杉醇的需求日益增长，紫杉醇的供求矛盾也日益突出，这促使人们尝试各种途径扩大紫杉醇的来源。自从1993年Stierle首次从红豆杉树皮中分离得到一株产紫杉醇真菌Taxomyces andreanae以来，越来越多的产紫杉醇内生真菌被分离出来，这为人们通过微生物发酵大规模工业生产紫杉醇提供了可能。
　　本研究从安徽石台县仙寓山一株百年野生南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)树皮中，分离得到一株产紫杉醇重要前体物质巴卡亭Ⅲ的内生真菌。经过形态学和分子生物学鉴定，将该真菌鉴定为拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis sp.)，并命名为TL9。通过单因素和4因素3水平正交实验确定了该真菌的最佳碳源和氮源，进而优化真菌的发酵培养基。
　　以分离得到的真菌为材料，根据南方红豆杉紫杉醇合成途径关键酶10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10β-乙酰转移酶(DBAT)的基因dbat的序列(AY365031.2)设计引物，同源克隆得到一段长为706 bp的片断，经BLAST序列比对确认为真菌dbat基因的核心片断，然后通过反向PCR技术，扩增得到一段长为753 bp的片断，经过序列分析后与核心片断进行拼接，得到一段长为1281 bp的片断。序列比对显示该片段与红豆杉植物dbat基因相似度达到97％，因此确认为真菌dbat基因的核心片断。
　　以真菌TL9为材料，测定真菌的生长曲线，确定处于对数生长期中期（约4天左右）为制备原生质体的最佳时间。通过选择合适的酶，调整酶的作用温度和作用时间，优化原生质体的制备流程。以潮霉素B为筛选剂，确定潮霉素B浓度150 ug/L适合作为真菌TL9遗传转化的筛选压浓度。以pCAMBIA1304和真菌表达载体pAN7-1为材料，构建了以潮霉素抗性基因为筛选标记适合用于根癌农杆菌转化的双元载体，并转化根癌农杆菌。以真菌TL9的原生质体为受体，考察了培养支持物、根癌农杆菌菌株、AS添加方式、AS浓度、原生质体浓度、根癌农杆菌的浓度、共培养条件等多方面因素，确定了适合该真菌的农杆菌转化条件，从而建立了根癌农杆菌介导的该真菌原生质体转化平台，最高转化率约为55个转化子/107个原生质体，并且潮霉素抗性稳定遗传。根据南方红豆杉(Taxuschinensis vat mairei)紫杉醇合成途径紫杉二烯合酶(Taxadiene synthase，TS)，10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10β-乙酰转移酶(10-deacetyl-baccatinⅢ-10β-O-acetyltransferase，DBAT)，3-氨基-3-苯基丙酰转移酶(3-amino-3-phenylpropanoyltransferase，BAPT)三个关键酶的基因序列设计引物，构建了紫杉醇合成途径关键酶基因真菌表达载体pTS，pDBAT，pBAPT，转化真菌TL9原生质体。检测结果表明，dbat基因转化产巴卡亭Ⅲ内生真菌TL9能够提高真菌巴卡亭Ⅲ的含量，dbat基因RNA的表达水平分析结果表明dbat基因表达量水平与真菌巴卡亭Ⅲ有较为明显的对应关系。
　　本研究为以后利用基因工程手段提高内生真菌紫杉烷类化合物含量打下了基础，并对在分子水平上理解内生真菌紫杉醇合成途径具有参考意义。

目录

声明

摘要

缩写词表

第一章 文献综述

1 前言

2 紫杉醇的简介

3 紫杉醇的抗癌机理

4 紫杉醇的生物合成

4．1 所有萜类合成前体物质IPP的合成

4．2 二萜类物质合成前体GGPP的合成

4．3 紫杉醇母核的合成

4．4 紫杉醇侧链的修饰

5 紫杉醇途径中关键酶

5．1 紫杉二烯合酶

5．2 细胞色素P450单加氧酶

5．3 酰基转移酶类

6 紫杉醇的来源

6．1 植物提取

6．2 化学全合成

6．3 化学半合成

6．4 植物细胞培养

6．5 微生物发酵

7 产紫杉醇内生真菌

7．1 产紫杉醇内生真菌的分离情况

7．2 提高产紫杉醇内生真菌产量的基本途径

8 丝状真菌的遗传转化

8．1 聚乙二醇(Polyethylene Glycol，PEG)介导转化法

8．2 醋酸锂(Lithium Acetate)转化法

8．3 电穿孔(Electroporation)转化法

8．4 微弹轰击(Biolistics)转化法

8．5 限制性内切酶介导整合法(Restriction Enzyme Mediated Integration，REMI)

8．6 根癌农杆菌介导转化法(Agrobacterium tumefaciens Mediated Transformation，ATMT)

9 本课题的研究意义

第二章 红豆杉产紫杉烷类化合物内生真菌的分离与鉴定

1 材料与试剂

1．1 植物材料

1．2 培养基

1．3 菌株和载体

1．4 试剂

1．5 试剂配制

1．6 仪器和设备

2 实验方法

2．1 红豆杉内生真菌的分离

2．2 红豆杉内生真菌的发酵培养及紫杉醇烷类化合物的提取检测

2．3 真菌菌丝体及孢子的形态学观察

2．4 真菌的分子生物学鉴定

2．5 真菌的培养条件优化

3 结果与讨论

3．1 红豆杉内生真菌的分离

3．2 内生真菌发酵产物的检测

3．3 真菌形态学鉴定

3．4 产巴卡亭Ⅲ内生真菌TL9的分子生物学鉴定

3．5 真菌TL9的培养条件优化

4 小结

第三章 TL9真菌10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10β-乙酰转移酶(DBAT)基因的克隆

1 材料与试剂

1．1 菌株和载体

1．2 试剂

1．3 仪器设备

2 实验方法

2．1 产紫杉醇内生真菌基因组DNA的提取

2．2 dbat基因核心片断的克隆

2．3 dbat基因核心片断两侧序列的克隆

3 结果与讨论

3．1 基因组DNA的提取

3．2 产紫杉醇内生真菌dbat基因核心片段的克隆

3．3 反向PCR克隆核心片段两侧序列

4 小结

第四章 真菌TL9原生质体制备以及根癌农杆菌介导的原生质体转化平台建立

1 材料与试剂

1．1 酶及试剂

1．2 菌株

1．3 仪器和设备

2 实验方法

2．1 原生质体的制备

2．2 根癌农杆菌介导的原生质体转化

3 结果与讨论

3．1 原生质体的制备条件的优化

3．2 潮霉素表达载体的构建

3．3 潮霉素浓度的筛选压确定

3．4 原生质体培养支持物的选择

3．5 根癌农杆菌菌种的影响

3．6 AS添加方式的影响

3．7 AS添加浓度的影响

3．8 原生质体浓度的影响

3．9 农杆菌菌液浓度的影响

3．10 共培养条件的影响

3．11 潮霉素抗性遗传稳定性结果

3．12 潮霉素抗性转化子的PCR验证

3．13 Southern blot实验结果

4 小结

第五章 关键酶基因的真菌表达载体构建

1 材料与试剂

1．1 菌株和载体

1．2 相关酶和试剂

2 功能基因构建思路

3 实验方法

3．1 红豆杉叶片RNA的提取

3．2 红豆杉ts基因、dbat基因、bapt基因以及启动子序列的克隆

3．3 bapt基因的点突变

3．4 中间载体的构建

3．5 关键酶基因的真菌表达载体构建

4 结果与讨论

4．1 RNA的提取结果

4．2 ts，dbat，bapt基因的RT-PCR结果

4．3 ts，dbat，bapt基因与pMD18 T simple载体相连接

4．4 gpdA基因启动子的克隆

4．5 bapt基因点突变的实验结果

4．6 中间载体的构建结果

4．7 功能基因表达载体的构建

5 小结

第六章 产巴卡亭Ⅲ内生真菌的紫杉醇合成途径功能基因的遗传转化

1 材料与试剂

1．1 菌种

1．2 试剂

1．3 仪器与设备

2 实验方法

2．1 根癌农杆菌EHA105感受态细胞的制备

2．2 质粒pTS，pDBAT，pBAPT转化根癌农杆菌EHA105

2．3 根癌农杆菌EHA105(pTS)，EHA105(pDBAT)，EHA105(pBAPT)的预培养

2．4 根癌农杆菌EHA105(pTS)，EHA105(pDBAT)，EHA105(pBAPT)的诱导培养

2．5 真菌TL9的原生质体制备

2．6 根癌农杆菌EHA105(pTS)，EHA105(pDBAT)，EHA105(pBAPT)转化真菌TL9的原生质体

2．7 潮霉素抗性转化子的纯培养

2．8 阳性转化子的基因组DNA提取

2．9 阳性转化子的PCR检测

2．10 真菌的发酵培养和紫杉烷类化合物的提取

2．11 HPLC-MS检测真菌发酵产物

2．12 阳性转化子的Southern Blot检测

2．13 真菌的基因表达量分析

3 结果与讨论

3．1 根癌农杆菌EHA105(pTS)，EHA105(pDBAT)，EHA105(pBAPT)的菌液PCR验证

3．2 功能基因载体转化真菌TL9原生质体

3．2 真菌转化子的PCR验证

3．3 真菌RNA的提取

3．4 转化子的次生代谢产物含量HPLC-MS分析

3．5 转dbat基因转化子的基因表达量分析

3．6 阳性转化子的Southern Blot分析

4 小结

第七章 总结与展望

1 总结

2 论文创新点

3 展望

参考文献

攻读博士学位期间发表文章

致谢