肝癌侵袭关键分子CD151功能复合体筛选及其在肝癌侵袭和转移中的作用研究

摘要

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，全球每年约有60万人死于肝癌，其侵袭转移与复发是患者死亡的主要原因之一。因此，探索肝癌侵袭转移与复发的发生机制，寻求有效的抗转移与复发治疗措施，对改善肝癌患者的预后及延长患者的生存时间具有重要意义。
　　 四跨膜蛋白(Tetraspanin，TM4SF)是一类小分子糖蛋白，因四次跨膜而得名。四跨膜蛋白的最重要生物学特征之一是在四跨膜蛋白富集区(tetraspanin-enriched microdomains，TEM)不同的四跨膜蛋白之间或与其他跨膜蛋白(如整合素，生长因子受体等)可以相互偶联，进而形成四跨膜网络。研究证实四跨膜蛋白功能包括对各种基本的细胞生理过程，如细胞分化、细胞移行、细胞与细胞外基质间的黏附、血小板凝集、细胞溶解和信号转导等进行调控，其功能主要通过影响网络内跨膜蛋白分子功能来实现，四跨膜蛋白分子表达异常与许多疾病的发生、发展密切相关。四跨膜蛋白CD151是四跨膜蛋白家族的重要成员之一，CD151对维持四跨膜网络的完整性有重要作用，其缺失或过表达均可破坏网络的稳定，对多种跨膜蛋白分子的功能产生重要影响。
　　 我们前期研究发现，四跨膜蛋白CD151在肝癌组织中呈过表达，其表达程度与肝癌预后相关，其过表达可以上调肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)/肝细胞生长因子受体(c-Met)信号；CD151可与整合素α6β1在肝癌细胞表面形成复合物，高表达CD151可选择性扩大整合素α6β1-PI3K信号导致核转录因子Snail的核聚集与激活，从而促进肝癌新生血管形成与上皮间质样转化的发生。
　　 考虑到四跨膜蛋白网络的特性及CD151在肝癌转移与复发中的重要地位，本课题拟通过免疫共沉淀联合液相色谱串联质谱分析技术筛选肝癌侵袭关键分子CD151功能复合体，运用生物信息学分析并特征化四跨膜蛋白CD151网络，利用Western blot验证筛选的关键蛋白并探讨与复合体的关系，采用基因转染与干扰技术诱导四跨膜蛋白CD151功能网络失衡，观察其对肝癌细胞侵袭和转移的影响，并在临床肝癌组织中加以验证。这将为揭示肝癌转移复发的发生机制，开发新的肝癌靶向治疗药物、进一步提高肝癌的治疗水平提供理论依据。
　　 第一部分、免疫共沉淀和液相色谱串联质谱分析筛选肝癌侵袭关键分子CD151的功能复合体
　　 目的：免疫共沉淀结合液相色谱串联质谱分析筛选肝癌侵袭关键分子CD151功能复合体。
　　 方法：应用CD151抗体从肝癌细胞株HCCLM3细胞蛋白中富集与CD151结合蛋白，通过质谱分析与多肽比对初步确立CD151功能复合体，采用免疫荧光对CD151与整合素β1表达进行定位，免疫共沉淀后Western blot验证此功能复合体，最后利用生物信息学建立CD151四跨膜蛋白网络。
　　 结果：免疫共沉淀后质谱鉴定出58个包括CD151蛋白。其中膜蛋白有包括整合素α3、α6、β1和c-Met、LDLR以及TNFα1R等，信号转导蛋白有包括14-3-3蛋白、p195/IQGAP1、HSP70、PKC、RuvB1与2、IKK等，通过免疫荧光显示CD151与整合素β1在细胞膜表面重叠表达，通过免疫共沉淀后的Western blot验证了整合素α6、β1与CD151形成复合物，证实了质谱分析结果的可靠性。通过生物信息学分析建立了以CD151为核心的三级网络示意图。
　　 结论：四跨膜蛋白CD151与整合素α6、β1分子在肝癌细胞表面形成复合物。
　　 第二部分、CD151与整合素β1相互作用及对肝癌细胞侵袭的影响
　　 目的：研究四跨膜蛋白CD151与整合素β1二者的相互作用以及对肝癌细胞侵袭的影响。
　　 方法：荧光定量PCR、Western blot、流式细胞仪检测不同转移潜能肝癌细胞中CD151与整合素β1表达情况；用RT-PCR、Western blot分析CD151-cDNA、shRNA-CD151、vshRNA-整合素β1转染前后肝癌细胞株中CD151与整合素β1表达的相互影响，用ELISA分析转染前后基质金属蛋白酶2、9表达变化，用划痕实验检测转染前后细胞移动能力变化，用Transwell研究肝癌细胞转染前后侵袭能力改变，用裸鼠转移模型分析肝癌细胞转染前后成瘤与肺转移能力的改变。
　　 结果：肝癌细胞株中CD151表达与其转移潜能成正相关，整合素β1在肝癌细胞株中均呈较高表达；成功转染肝癌细胞，发现CD151与整合素β1的表达与MMP9的分泌呈正相关，而对MMP2的影响较小；CD151与整合素β1共高表达的肝癌细胞移动与侵袭能力明显增强，肺转移灶明显增加。体内外实验表明，高表达CD151和整合素β1肝癌细胞干扰CD151或整合素β1后，肝癌细胞的侵袭转移能力明显下降，而低表达CD151、高表达整合素β1肝癌细胞干扰整合素β1后，肝癌细胞的侵袭转移能力未见明显改变。
　　 结论：四跨膜蛋白CD151过表达促进肝癌细胞侵袭与转移，但有赖于整合素β1表达。
　　 第三部分、CD151与整合素β1在临床肝癌组织中的表达与预后关系
　　 目的：研究CD151和整合素β1在原发性肝癌中表达，探讨其临床意义。
　　 方法：采用定量PCR和RT-PCR对120例肝癌标本和20例正常肝中整合素β1表达进行检测。应用组织芯片结合免疫组织化学染色检测301例肝癌组织中CD151与整合素β1蛋白的表达，统计分析其与肝癌临床病理特征及预后的关系。
　　 结果：定量PCR检测显示整合素β1在肝癌组织中高于癌旁和正常组织(p<0.05)；易早期复发肝癌组织中整合素β1表达略高于无早期复发的肝癌组织。组织芯片结合免疫组化分析显示：肝癌组织中CD151过表达与多结节肿瘤(数目>1，p=0.46)、微血管侵犯(p=0.01)、大肿瘤(直径>5cm，p=0.027)以及高TNM分期(p=0.001)相关：而整合素β1与微血管侵犯(p=0.028)、大肿瘤(直径>5cm，p=0.04)、高TNM分期(p=0.046)相关。CD151+组的3、5、7年总体生存率明显低于CD151-组(p<0.01)，而3、5、7年累积复发率显著高于后者。CD151+/整合素β1+组的3、5、7年总体生存率明显低于CD151+/整合素β1-、CD151-/整合素β1+和CD151-/整合素β1-组(p<0.01)。COX多因素分析显示：CD151、CD151/整合素β是判断肝癌患者预后不良的独立因素。
　　 结论：四跨膜蛋白CD151与整合素β1功能复合物表达与原发性肝癌的侵袭、转移及不良预后相关。