VEGFR-1在肝癌细胞中的异常表达及其对肝癌侵袭转移关键分子Snail、MMP-9的调控效应与机制研究

摘要

研究背景与目的
　　 原发性肝癌是严重威胁人类生命的恶性肿瘤之一。尽管在早期诊断和治疗方法上有了很大改进，但是仍不能改变其不良预后，肿瘤侵袭、肝内扩散和肝外转移是导致治疗失败是主要原因。因而了解侵袭转移的分子机制对肝癌治疗有着重要的指导意义。另外，临床上经常遇到即使具有相似的分化程度、肿瘤大小和肝内转移等病理特征，术后患者的复发、转移和生存状况仍具有较大差异。因此，准确判断患者的预后对于确定有效的治疗方案和提高患者的生活质量具有重要的意义。虽然很多研究聚焦于发现特异性的分子标志来满足准确预测肝癌预后的需要，但目前此类有价值的指标仍然很有限。
　　 近来研究显示，上皮组织来源的恶性肿瘤中异常表达的生长因子受体对于肿瘤的进展与侵袭转移发挥了重要的调控效应。血管内皮生长因子受体-1(VEGF-1)是一类表达在血管内皮细胞表面，能够有效促进血管形成的生长因子受体家族成员，参与生理性和病理性血管的形成。但新近研究在多种实体肿瘤细胞上发现了“异位”表达的功能性VEGFR-1，并且通过其配体（VEGF-B和PIGF）特异性激活后，能够显著增强肿瘤细胞的侵袭转移能力。这提示肿瘤细胞中的异常表达的VEGFR-1具有独立于血管生成的促进肿瘤进展的效应。原发性肝癌是上皮来源、血运丰富、高侵袭转移性的实体肿瘤。肝癌组织细胞是否表达功能性VEGFR-1?其激活后是否与肝癌的侵袭转移有关？具体机制如何？目前尚未见系统研究和报道。
　　 原发性肝癌的侵袭转移以肝内转移和血管侵袭最为常见，表现为大瘤体周围的卫星转移灶和门静脉瘤栓的形成。细胞外基质(ECM)和血管基底膜的降解是肝癌细胞侵袭转移过程中不可或缺的步骤之一，两者的降解主要是蛋白水解酶尤其是基质金属蛋白酶家族(MMPs)的作用结果。明胶酶MMP-9和MMP-2是MMPs家族的重要成员，其对ECM的降解是肿瘤细胞侵袭转移的关键步骤。MMP-9表达的增高及功能的增强在肿瘤细胞的病理性迁移、侵袭过程中起着重要的促进作用。Snail、Ras、v-Src等基因编码的核转录因子能够激活MMP-9的转录，而包括VEGF在内的多种细胞因子也能够刺激MMP-9的表达和分泌。那么作为高侵袭转移能力的原发性肝癌，也极有可能通过VEGFR-1的激活对金属蛋白酶的调控而介导其进一步的侵袭、转移。
　　 基于以上陈述，本研究通过研究肝癌细胞上功能性VEGFR-1的表达和作用效应，结合肝癌病人的临床病理表现和预后，考察VEGFR-1表达水平和病人病理特征和预后的关系;并通过外源性激活VEGFR-1，探究VEGFR-1激活后对肝癌侵袭转移能力的影响及其分子机制。
　　 第一部分
　　 VEGFR-1、Snail和MMP-9在原发性肝癌中的表达与临床意义
　　 研究目的
　　 1、检测VEGFR-1、Snail和MMP-9在不同侵袭力的肝癌细胞株中的表达定位与表达水平，分析其与肝癌侵袭力的相关性。
　　 2、分析VEGFR-1、Snail和MMP-9的表达与肝癌的临床分期、病理分级、包膜完整性、肝内转移等临床病理特征的关系。
　　 3、分析VEGFR-1、Snail和MMP-9在肝癌组织中表达水平的相关性。
　　 4、分析VEGFR-1、Snail和MMP-9的表达水平与肝癌术后患者复发和预后的关系。
　　 研究方法
　　 1、培养不同侵袭力的肝癌细胞株，应用细胞荧光免疫法检测VEGFR-1、Snail和MMP-9在肝癌细胞中的表达与定位，WesternBlot检测此三种分子在不同肝癌细胞株中表达水平。
　　 2、收集未经任何抗肿瘤治疗的肝癌患者手术中肝癌组织和对应癌旁组织标本，脱水、石蜡包埋后制作组织芯片，采用免疫组织化学法，检测VEGFR-1、Snail和MMP-9在肝癌组织和癌旁组织中的表达水平。
　　 3、采用生存分析和受试者工作特征曲线(ROC)分析VEGFR-1、Snail和MMP-9等临床因素与肝癌术后患者复发和预后的关系。
　　 结果
　　 1、VEGFR-1、Snail和MMP-9在不同侵袭力的肝癌细胞系中的表达定位、表达水平及其与细胞侵袭能力的相关性。
　　 1、WesternBlot结果显示，四种肝癌细胞系(Hep3B，HepG2，SMMC-7721，MHCC-97H)中均有不同程度的VEGFR-1、Snail和MMP-9的表达。VEGFR-1主要表达在肝癌细胞的细胞膜，Snail主要定位于细胞核而MMP-9主要定位于细胞浆内。
　　 2、高表达VEGFR-1的肝癌细胞株MHCC-97H中，Snail和MMP-9的表达亦处于高水平，且与其他肝癌细胞株相比，其侵袭力也较强。
　　 2、VEGFR-1、Snail和MMP-9在肝癌组织和癌旁组织中的表达水平及相关性。
　　 VEGFR-1、Snail和MMP-9在原发性肝癌组织和对应的癌旁组织中表达的位置与其在肝癌细胞系中的表达一致。VEGFR-1和Snail两者在癌组织中表达显著高于癌旁组织中的表达(均p＜0.001);MMP-9在癌旁组织中的表达显著高于癌组织(p=0.044)。癌组织中VEGFR-1的表达水平与Snail以及MMP-9的表达水平呈显著的正相关(r=0.418，p＜0.001;r=0.232，p=0.036)。
　　 3、VEGFR-1、Snail和MMP-9的表达与临床病理特征的关系。
　　 肝癌组织中VEGFR-1、Snail的表达水平与TNM分期、肝内转移、微血管侵袭显著性正相关(p＜0.05)，而与病理分级呈显著性负相关(p＜0.05）;此外Snail的高表达还与包膜侵袭有关(p＜0.05)，而MMP-9的高表达仅与肝内转移有关(p＜0.05）。
　　 4、单因素生存分析各个临床病理特征以及VEGFR-1、Snail和MMP-9对肝癌病人复发和生存的影响。
　　 肝癌病人复发和死亡的有关系的因素有:肿瘤大小、微血管侵袭、肝内转移、肿瘤包膜完整和TNM分期。肝癌组织中VEGFR-1高表达的病人的无肿瘤复发时间和生存时间都要显著少于VEGFR-1低表达的病人(p＜0.001;p=0.023）;而肝癌组织中Snail高表达病人的无肿瘤复发时间和生存时间都要显著少于Snail低表达的病人(均p＜0.0001);MMP-9对无肿瘤复发时间和生存时间无明显相关关系。
　　 5、多因素生存分析各个临床病理特征对肝癌病人复发和生存的危险性。VEGFR-1和Snail的高表达均是影响复发和生存的独立危险因素(危险度[HR]分别为=1.876，p=0.003;HR=1.759,p=0.032)。
　　 6、ROC分析各个临床病理特征对肝癌病人复发和生存的诊断效率。
　　 联合VEGFR-1和Snail对复发的诊断效率优于其他单一因素的(曲线下面积为:0.784;95％CI，0.642to0.927;p=0.002)，另外联合两者对死亡也有诊断效率(曲线下面积为:0.685;95％CI，0.567to0.803;p=0.005)。
　　 结论
　　 1、肝癌细胞上存在VEGFR-1的表达，主要定位于细胞膜。
　　 2、癌组织细胞上高表达的VEGFR-1与肝癌侵袭进展和不良预后正相关，有望成为肝癌术后患者判断预后的新的预测标志。
　　 3、联合检测癌组织中VEGFR-1和Snail的表达水平能有效判断肝癌术后患者的预后，尤其是复发。
　　 第二部分VEGFR-1通过Snail、MMP-9的表达上调对肝癌细胞侵袭转移能的影响
　　 研究目的：
　　 1、检测外源性激活VEGFR-1后对肝癌细胞迁移、侵袭能力的影响。
　　 2、检测外源性激活VEGFR-1后肝癌细胞MMP-9表达水平的变化，并进一步研究选择性阻断MMP-9的作用后肝癌细胞侵袭力的变化。
　　 3、检测Snail在VEGFR-1激活后的表达水平变化。
　　 研究方法
　　 1、加入外源性VEGFR-1特异性配体VEGF-B167激活VEGFR-1，细胞划痕实验和侵袭实验检测肝癌细胞迁移、侵袭能力的变化。
　　 2、WesternBot、qRT-PCR检测VEGFR-1激活后，肝癌细胞MMP-9和Snail的表达变化。
　　 3、明胶酶谱法检测肝癌细胞VEGFR-1激活后，细胞培养上清中MMP-9明胶酶活性的变化。
　　 4、加入MMP-9和MMPs特异性阻断试剂，阻断其作用，观察肝癌细胞侵袭能力变化。
　　 5、结合肝癌组织芯片免疫组化结果，分析肝癌组织内VEGFR-1和MMP-9表达水平与临床病理特点及预后的关系。
　　 结果
　　 1、VEGFR-1激活后促进SMMC-7721细胞的迁移、侵袭能力。
　　 1)细胞划痕实验检测VEGFR-1激活后对SMMC-7721细胞迁移能力的影响。在12h观察点，实验组相对迁移率为58.6±1.1％，非特异性IgG处理组为60.3±1.1％，空白对照组为60.5±1.8％;实验组与非特异性IgG组处理组、空白对照组相比细胞相对迁移率无显著变化(p＞0.05）。而在24h观察点，实验组细胞相对迁移率为1.4±1.1％，非特异性IgG对照组为12.3±1.6％，空白对照组为8.4±1.2％;实验组与非特异性IgG对照组相比，差异有统计学意义(p＜0.05）。
　　 2)细胞侵袭实验检测VEGFR-1激活后对SMMC-7721细胞侵袭能力的影响。48h观察点，实验组侵袭到下层的细胞数显著高于非特异性IgG对照组(p＜0.05）。
　　 2、VEGFR-1激活后促进肝癌细胞MMP-9表达和活性增强。
　　 (1)qRT-PCR检测VEGFR-1激活后肝癌细胞中MMP-9的表达情况:32h观察点，在SMMC-7721细胞中，MMP-9mRNA上升达最高，约为对应时间点非特异性IgG对照组的4.3倍;HepG2细胞中MMP-9mRNA表达也在32h处到达最高，约为对应非特异性IgG对照组的2.6倍。
　　 (2)WesternBlot和明胶酶谱实验检测MMP-9蛋白水平和活性变化:WesternBlot结果显示，VEGF-B167处理组在32h后两种细胞的MMP-9蛋白水平表达显著增加，增加以酶原形式为主，活化形式的MMP-9未见明显增加。明胶酶谱检测显示，在SMMC-7721细胞中，VEGF-B167处理组MMP-9的明胶酶活性较对照组显著增加;HepG2细胞中，处理组的MMP-9和MMP-2的活性均增加。
　　 1、细胞免疫荧光检测SMMC-7721和HepG2细胞在VEGF-B167处理前后MMP-9的荧光强度变化，结果显示两种肝癌细胞株VEGFR-1激活后的MMP-9表达较对照组明显增强。
　　 3、VEGFR-1激活后所导致的肝癌细胞侵袭力的增强是MMP-9依赖的
　　 加入金属基质蛋白酶抑制剂(GM6001)后，48h观察点结果显示，GM6001处理组与对照组相比，侵袭细胞数目显著减少(p＜0.0001）。
　　 加入选择性MMP-9的功能性阻断剂Ab-1后，48h观察点结果显示，相比未加入Ab-1的VEGF-B167处理组，一并加入Ab-1和VEGF-B167的处理组的侵袭细胞数目明显降低(32±2.6vs.50±7.6，p＜0.01);同时，加入Ab-1的VEGF-B167处理组与加入Ab-1的非特异性IgG处理组相比，侵袭细胞数目无显著差别(32±2.6vs.24±4.0,p＞0.05)。
　　 4、VEGFR-1激活后肝癌细胞Snail的表达显著上调
　　 (1)qRT-PCR检测VEGFR-1激活后SMMC-7721和HepG2两种肝癌细胞株的Snail表达变化:在28h观察点，SMMC-7721细胞的SnailmRNA升高到最高，约为非特异性IgG对照组的8.5倍;HepG2细胞也在24h达到最高，约为非特异性IgG对照组的2.2倍。
　　 (2)WesternBlot检测VEGFR-1激活后Snail蛋白表达水平的变化:SMMC-7721和HepG2两种肝癌细胞系在VEGFR-1激活28h后，肝癌细胞中Snail蛋白表达水平显著增加。
　　 结论：
　　 1、肝癌细胞中VEGFR-1激活后，能够通过增强MMP-9介导的对细胞外基质蛋白水解效应这一肝癌细胞的侵袭转移的新机制，促进肝癌进展和侵袭转移。
　　 2、VEGFR-1在肝癌中的异常表达与激活，能够通过激活Snail介导的MMP-9的表达上调发挥促侵袭效应。