激活LXR通过减少膜胆固醇含量下调β-分泌酶活性

摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)是常见的神经系统退行性疾病，其典型病理特征为老年斑的沉积和神经原纤维的缠结。老年斑的主要成分是β-淀粉样多肽(beta-amyloid，Aβ)，由淀粉样前体蛋白(amyloidprecursorprotein，APP)在两种蛋白酶即β-分泌酶和γ-分泌酶的先后裂解作用下产生。β-分泌酶也称为BACE1(Beta-siteamyloidprecursorproteincleavingenzyme1)，在Aβ的生成中起了至关重要的作用，是Aβ产生过程中的限速酶。很多研究证明胆固醇异常和AD存在着密切的联系。临床研究显示高胆固醇血症病人患AD的几率也明显增加。研究报道AD病人的脑中存在胆固醇代谢异常。动物实验表明，长期给予家兔高胆固醇饮食会促进老年斑的生成，相反，用降胆固醇药物能明显降低Aβ的水平。肝X受体(LiverXreceptor，LXR)是配体依赖性的核转录因子，可调控多个与胆固醇代谢有关的基因如ATP-结合盒转运体A1(ATP-bindingcassettetransporterA1，ABCA1)和载脂蛋白E(ApolipoproteinE，ApoE)的表达，在维持胆固醇稳态中发挥重要作用。LXR分为LXRa和LXRβ两种亚型。LXR分布广泛，在肝脏、脂肪组织和巨噬细胞分布较多，在脑内也有表达。LXR的配体包括天然的氧化甾醇(oxysterol)如：24(S)-羟基胆甾醇和27-羟基胆甾醇，以及人工合成的T0901317、GW3965。人工合成的LXR激活剂可以减少Aβ的生成，但机制不明。
　　那么，如果用人工合成的LXR激活剂T0901317处理APP/PS1转基因小鼠后，脑内胆固醇稳态是否发生改变?参与APP代谢的分泌酶的活性是否受到影响?激活LXR引起Aβ生成减少的原因是什么?针对这这些问题，本课题集中研究激活LXR对APP/PS1转基因AD模型小鼠及对原代培养神经元胆固醇稳态和β-分泌酶活性与Aβ生成的关系，以探讨AD发病的相关分子机制，为临床AD的预防和治疗提供新的实验依据。主要进行了以下两方面的工作：
　　1、激活LXR对AD模型小鼠脑内胆固醇稳态和β-分泌酶活性的影响。运用real-timePCR技术和Westernblot检测LXR激活剂T0901317对LXR下游基因和蛋白的表达，结果显示，T0901317上调APP/PS1转基因小鼠脑内ABCA1和ApoE的表达。在T0901317处理组APP/PS1转基因小鼠额叶皮层和海马脑区总胆固醇含量没有发生明显改变，而膜胆固醇含量显著低于对照组。与对照组相比，T0901317处理组的APP/PS1转基因小鼠脑内老年斑的面积百分比减少，差异有统计学意义；ELISA方法检测Aβ的水平，与对照组相比，T0901317处理组显著减少了小鼠脑组织中Aβ40和Aβ42的含量。通过Westernblot方法检测BACE1蛋白表达水平，结果可见，T0901317处理组BACE1蛋白水平减低，提示激活LXR能减少APP/PS1转基因小鼠脑内BACE1蛋白表达水平，能改善APP/PS1转基因小鼠学习记忆能力。上述结果表明在APP/PS1转基因动物，激活LXR具有降低BACE1蛋白表达、β-分泌酶活性和减少老年斑生成的作用。
　　2、激活LXP下调β-分泌酶活性的机理研究。为揭示激活LXR降低β-分泌酶活性和减少老年斑生成的原因，应用real-timePCR、Westernblot及免疫荧光染色技术深入研究从APP/PS1转基因小鼠海马提取的原代培养神经元经T0901317处理后ABCA1的表达变化、膜胆固醇含量的变化及对β-分泌酶活性的影响。我们发现，加入外源的胆固醇可以增加APP/PS1原代培养神经元膜胆固醇的含量，上调β-分泌酶的活性。用甲基-β-环糊精抽提胆固醇后发现，APP/PS1原代培养神经元膜胆固醇含量减少，并伴随着β-分泌酶活性降低和Aβ生成减少。提示膜胆固醇的含量能影响到β-分泌酶的活性。T0901317处理细胞后，ABCA1mRNA表达显著高于对照组，膜胆固醇含量和β-分泌酶活性降低。为了进一步证明.ABCA1在T0901317诱导的膜胆固醇水平降低过程中所起的作用，用ABCA1的抑制剂glyburide处理原代培养神经元，结果表明glyburide能够逆转T0901317的降低膜胆固醇含量和降低β-分泌酶活性的作用，提示T0901317下调β-分泌酶活性的能力需要ABCA1的参与。为了验证LXR在T0901317上调ABCA1表达和下调β-分泌酶活性过程中是否起作用，用LXR的拮抗剂GGPP(geranylgeranylpyrophosphate，GGPP)和T0901317共处理原代培养神经元，发现用LXR拮抗剂后，T0901317上调ABCA1表达、降低膜胆固醇和降低β-分泌酶活性这些作用几乎消失，说明用LXR拮抗剂阻断LXR能逆转T0901317对原代培养神经元ABCA1、膜胆固醇含量和β-分泌酶的作用。
　　综上所述，我们的实验提示：激活LXR可改变APP/PS1转基因小鼠脑内胆固醇的稳态，减少BACE1蛋白的表达，降低β-分泌酶活性和老年斑的生成。激活LXR是通过ABCA1下调膜胆固醇水平，从而使β-分泌酶活性降低和Aβ生成减少。