特异基因组位点整合的GLP-1基因治疗策略——GLP-1融合蛋白持续表达对小鼠能量稳态的调控

摘要

胰升血糖素样多肽-1(GLP-1)是由小肠黏膜内分泌L细胞合成并分泌的肠促胰岛素激素。GLP-1的主要作用是在胰腺内，包括血糖依赖性的增加胰岛p细胞分泌胰岛素和抑制胰岛α细胞释放胰升血糖素；促进胰岛β细胞增殖和再生，抑制胰岛β细胞凋亡，从而提升胰岛β细胞质量和胰岛β细胞功能。另外，GLP-1还可以增加外周组织如肝脏和肌肉的胰岛素敏感性，减少肠蠕动，增加饱感和减轻体重。天然GLP-1在体内的半衰期很短，不足2分钟，这限制了天然GLP-1在临床的应用价值。因此，目前对GLP-1的研究重点之一就放在了延长其的作用时间。GLP-1类似物显著延长了GLP-1在体内的作用时间，但是仍然需要每天或者每周给药。GLP-1的基因治疗，起到了很好的调控血糖的作用，但是在这些方法中，GLP-1的DNA是仍游离存在于靶细胞基因组外，不能实现GLP-1在体内长期作用。
　　腺相关病毒(AAV)是一种非病原性的复制缺陷型人类病毒，能够特异的将其基因定点整合到人基因组19号染色体长臂(19q13.4)的特定位点(AAVS1)。AAVS1位点被证实是一个安全的可用于外源基因整合的位点。所以，来源于AAV的重组载体，具有不引起转导细胞免疫反应和插入性突变的特点，并能介导转基因的长期表达。以上特点使重组AAV载体成为目前理想的基因治疗载体。对AAV的研究发现，其表达的Rep68/78蛋白和基因组中的RBE元件能够有效的介导AAV的基因组整合。但是由于Rep68//78蛋白还有基因组复制的功能，重组AAV病毒载体系统失去了基因组整合能力。所以，我们需要寻找一种新的基因治疗策略，使重组AAV载体既能有效转染靶细胞，又能将转基因定点整合到AAVS1位点。
　　在这里，我们采用了一种非病毒的基因治疗策略：构建2个载体，一个载体用于表达Rep78蛋白，即Rep78/VRnew，另外一个载体用于表达我们的GLP-1/Fc蛋白，并且在GLP-1/Fc启动子的上游插入一个RBE元件，即RBE/GLP-1/Fc；我们设想将这2个质粒共转移进入靶细胞后，短暂表达的Rep78蛋白协同RBE元件将引导GLP-1/Fc的DNA整合到细胞基因组中。使用PCR结合DNA杂交的方法检测基因组整合。我们的结果显示，GLP-1/Fc以一种Rep78蛋白依赖的方式整合到293细胞基因组的AAVS1位点。使用肌肉注射及电击的方法将质粒RBE/GLP-1/Fc和Rep78/VRnew转移到AAVS1转基因小鼠的肌肉细胞中，我们发现GLP-1/Fc基因整合到转基因小鼠的AAVS1位点，而没有整合到与肝癌密切相关的插入性突变位点mir-341位点。随着基因组的整合，利用免疫组织化学方法在DNA注射部位检测到GLP-1/Fc融合蛋白的表达，利用酶连免疫吸收实验(ELISA)检测到循环中活性GLP-1的水平持续升高。在高脂饮食(HFD)的小鼠模型，结果证实GLP-1/Fc基因治疗明显延缓了小鼠的体重增长和进食量。而且，GLP-1/Fc治疗小鼠的血脂(甘油三脂)水平降低、激素Leptin和Ghrelin水平恢复到正常水平。并且，GLP-1/Fe治疗显著提升了外周组织的胰岛素敏感性。以上结果支持我们的研究揭示了一种新的、无明显副作用的、特异基因组位点整合的非病毒GLP-1基因治疗方法。