雌激素增强大鼠脊髓背角浅层神经元的突触可塑性：非基因组机制

摘要

随着女性社会地位的提高，疼痛的性别差异也日益受到重视。雌激素是一类重要的女性激素，属类固醇类激素。天然雌激素有雌二醇、雌三醇及雌酮，17β-雌二醇(estradiol, E2)是女性体内最强的天然雌激素。
　　大量研究表明，雌激素(estrogen)可作用于神经系统而影响疼痛的程度，但雌激素发挥促痛作用还是抗痛作用尚没有明确的定论，所涉及的机制也并不完全明确。考虑到目前多种疼痛更多的困扰着女性，使寻找和发现治疗的新靶点变得更为迫切。
　　关于雌激素对疼痛的调节在过去几十年内大部分都集中在核雌激素受体(nucleus estrogen receptor, nER)介导的基因组作用，即慢性作用。关于它对疼痛的非基因组作用即快速作用的研究甚少。那么，雌激素是否参与疼痛的快速调节呢？如果参与，调节机制是什么呢？
　　既往研究表明，雌激素对海马等脑区的兴奋性突触传递和长时程增强(long-term potentiation，LTP)有快速调节作用，对海马LTP相关的学习记忆也有影响。那么E2是否也可以快速调节痛觉通路上的兴奋性突触传递和脊髓LTP呢？如果发挥快速调节作用，其机制又是什么呢？本研究围绕这一系列问题，采用离体脊髓切片全细胞膜片钳记录和场电位记录、行为学、免疫组织化学等实验方法，初步探讨了E2对疼痛的快速调节作用、E2对脊髓背角(spinal cord dorsal horn，SCDH)兴奋性突触传递和LTP的影响及其可能的细胞分子机制。主要结果如下:
　　1.内源性和外源性雌激素参与疼痛的急性调节
　　鞘内给予E2(≤30min)可引起机械性触诱发痛和热痛觉过敏，此作用可被雌激素受体的拮抗剂ICI182，780阻断，被膜雌激素受体(membrane estrogenreceptor, mER)的激动剂E2-BSA所模拟。给予ER(estrogen receptor, ER)的拮抗剂可抑制足底注射福尔马林引起的晚时相痛行为。以上表明，外源性和内源性雌激素参与对疼痛的急性调节。mER可能参与了E2的急性致痛作用。
　　2.雌激素受体的亚细胞分布
　　免疫组织化学和免疫细胞化学的结果显示:ERα/β与神经元的标记物NeuN、神经元骨架的标记物MAP2、谷氨酸能神经元的标记物Glutamate(Glu)有很好的共标，GPR30与MAP2和Glu也有较好共标，提示三种雌激素受体在谷氨酸能的神经元上均有表达;另外，活细胞免疫细胞化学结果显示:结合有FITC的不透膜雌激素E2-BSA可特异性的结合膜上的受体，显示空心状的点状着色，提示膜上有mER的分布，这种点状着色与NR1和GluR1有较好共存。
　　3.雌激素快速增强NMDA电流和NMDA-eEPSC
　　运用脊髓背角全细胞膜片钳技术，急性灌流E2(5-10 min)可浓度依赖性的增强脊髓背角浅层神经元上外源性NMDA(N-methyl-D-aspartic acid)引起的电流，而对AMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid)电流的影响在各个细胞并不一致，总的呈现不变;胞内给予G蛋白抑制剂GDP-β-S可阻断E2对NMDA电流的增强作用，提示雌激素可通过GPCR(G protein coupledreceptor)快速增强突触后NMDAR的功能。
　　进一步，我们在电刺激背根刺激诱发的eEPSC观察了E2对NMDA介导的成分(NMDA-eEPSCs)和AMPA介导的成分(AMPA-eEPSCs)的影响。E2灌流5-10 min可明显增大NMDA-eEPSCs/AMPA-eEPSCs的比值，该效应主要与E2增大NMDA-eEPSCs成分相关;急性灌流E2可快速(5-10 min)增强NMDA-eEPSCs，且至少可持续到E2洗脱后30分钟，即E2可诱导出NMDA-eEPSCs的化学性LTP(chemical LTP, c-LTP);相反，E2对AMPA-eEPSCs有轻微减小作用;E2诱导的c-LTP可被ERβ的激动剂DPN模拟，而不能被ERα的激动剂PPT模拟，提示雌激素可能通过激活ERβ增强MDAR介导的突触传递。
　　4.雌激素增加突触前递质释放概率
　　急性灌流E2(5-10 min)可快速减小eEPSC的配对脉冲比值(paired pulse ratio PPR)，而对mEPSC/sEPSC的频率和幅度无影响;提示E2可增加突触前递质释放概率。
　　5.雌激素通过调节NMDA受体NR2B易化初级传入诱导的脊髓背角LTP
　　高频刺激(high frequency stimutilation，HFS)初级传入进入脊髓的李骚氏束(Lissauer's tract, LT)可稳定诱导出脊髓背角浅层fEPSP的LTP(HF S-LTP)。E2预孵育40-60 min不仅可降低LTP的诱导阈值，还可以增强HFS-LTP的幅度，此作用可被ER的拮抗剂阻断且可被mER的激动剂E2-BSA部分模拟。提示E2对LTP的易化作用有mER的参与。
　　通过药理学分离的方法，在LT给予电刺激可在脊髓背角浅层记录到NMDA-eEPSC。给予E2预孵育40-60分钟后给予HFS，与溶剂组对比;E2组明显增强，提示E2可能是通过增强NMDAR的功能而增强HFS-LTP的。另外，NR2B的拮抗剂Ro25-6981可阻断E2对LTP的易化作用，提示含NR2B的NMDAR功能的增强参与了E2对LTP的易化作用。
　　脊髓背角原代神经元培养结合Western blot的结果显示:急性给予E210min即可增加pNR2B，且可以增加膜上的NR2B的水平。提示，E2不仅可以通过对NR2B的功能性调节还可通过上调膜上NR2B的数量从而增强NMDA突触传递和脊髓LTP。
　　6.PKA/ERK信号通路可能参与了E2对脊髓背角HFS-LTP的增强作用
　　在培养的脊髓背角神经元上给予E210min即可增加pPKA的表达;免疫组织化学结合脊髓切片急性药物孵育的方法发现，雌激素孵育10 min即可使活化的脊髓背角浅层pERK阳性神经元的数量达到高峰;另外，雌激素激活的pERK与pPKA有较好共存;在体鞘内给予E2也可快速增加脊髓背角pERK的表达，10 min达到高峰，30min基本恢复到正常水平，E2对pERK的激活作用可被mER的激动剂E2-BSA所模拟;电生理学结果显示，PKA的拮抗剂H89或ERK的阻断剂PD98059不仅可阻断E2对HFS-LTP的易化作用，还可完全阻断脊髓LTP,说明PKA和ERK对脊髓LTP的形成是必需的。以上提示E2对脊髓LTP的增强可能通过PKA/ERK信号通路介导。
　　综上所述，本研究发现，内源性和外源性雌激素可对疼痛进行快速调节;雌激素可快速增强脊髓背角浅层神经元NMDAR介导的兴奋性突触传递，并对脊髓背角LTP具有增强作用;pNR2B/pPKA/pERK信号通路可能参与了E2对NMDA-eEPSC和HFS-LTP的增强作用，进而参与E2诱发的行为敏化机制。

目录

缩略词表

摘要

一、前言

二、材料和方法

1 材料

1．1 实验动物

1．2 实验药品及试剂

1．3 实验仪器及工具软件

2 实验方法

2．1 行为学实验

2．2 脊髓切片的制备及电生理记录

2．3 脊髓神经元原代培养

2．4 免疫荧光化学实验

2．5 Western blot

三、结果

1 外源性和内源性雌激素参与疼痛的调节

1．1 外源性雌激素参与疼痛的调节

1．2 内源性雌激素参与疼痛的调节

2 雌激素受体在脊髓背角神经元的分布

3 雌激素对兴奋性突触传递的调节

3．1 雌激素对脊髓背角神经元基本电生理学特性的影响

3．2 雌激素对脊髓背角神经元兴奋性突触传递的影响

3．3 雌激素对抑制性突触传递的影响

3．4 雌激素对初级传入诱导的脊髓背角LTP的影响

4 雌激素作用的信号通路

4．1 NR2B可能参与E2对LTP的易化现象

4．2 NMDA／PKA／ERK可能参与E2对兴奋性突触传递和LTP的调节

四、讨论

五、总结

参考文献

综述 雌激素对突触传递和突触可塑性的影响

一、博士期间己发表或待发表的文章

二、参加学术交流

致谢

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