左旋多巴制剂生物利用度及遗传多态性研究

摘要

目前在临床上，左旋多巴(Levodopa，L-DP)是治疗帕金森病(Parkinson's disease，PD)的最有效药物，它是多巴胺（Dopamine，DA）的前体药物。它可以通过血脑屏障，并在脑内被多巴脱羧酶(Dopa decarboxylase，DDC)脱羧转化成DA而发挥作用。由于DDC不仅存在于脑中，在其他脏器和血管壁细胞内也广泛存在，如单用L-DP，仅约1％药物能进入中枢，故临床上多采用L-DP合并外周多巴脱羧酶抑制剂(Dopadecarboxylase inhibitor，DDCI)如卡比多巴(Carbidopa，C-DP)或苄丝肼(Benserazide，BSZ)制成复方制剂，以此提高L-DP进入中枢的量。其中，卡左双多巴控释片（商品名:息宁(@)）为目前国内较常用的L-DP复方制剂。
　　口服L-DP后，L-DP吸收迅速，并在体内很快被代谢。它主要经两条途径代谢，一条是经DDC脱羧成DA，另一条是经儿茶酚胺氧位甲基转移酶(Catechol-O-methyltransferase，COMT)代谢成3-氧甲基多巴(3-O-methyldopa，3-OMD)。在合用外周DDCI如C-DP情况下，经COMT代谢则成为L-DP主要代谢途径。但临床发现，患者给予L-DP制剂后，血药浓度随个体差异波动很大。
　　COMT是体内具有生物活性或毒性的儿茶酚胺类结构的化合物的主要代谢酶，如DA和L-DP。它是L-DP代谢途径中重要的代谢酶，COMT体内活性差异对其底物药物的代谢有重要影响，而L-DP是COMT的底物药物，所以COMT的基因多态性可能是L-DP及其代谢物3-OMD产生药动学个体差异的一个重要原因。
　　本课题模拟临床给药方案，考察了中国男性健康志愿者服用3种L-DP制剂给药方案达稳态后L-DP的药动学特征及生物利用度比较，并考察了COMT基因多态性与L-DP及其代谢物3-OMD药动学的相关性。
　　在第一章中，建立了同时测定人血浆中L-DP、3-OMD和BSZ或C-DP的高效液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)，并对方法进行验证。药物血浆测定的预处理方法采用甲醇蛋白沉淀法。色谱条件:色谱柱为YMC PACK MB-ODS（150 mm×2.1 mm，3μm）;柱温:50℃:流动相:甲醇:0.5％甲酸溶液(30∶70，v/v);流速:0.15 mL/min;质谱条件:离子源:电喷雾离子源(ESSI);检测:正离子检测;扫描方式:多反应监测(Multiple reactionmonitoring，MRM);雾化气流速:10 L/min;气帘气流速:10 L/min;碰撞气流速:4 L/min;喷雾电压:5000 V;离子源温度:500℃;采用BSZ或C-DP为内标(Internal standard，IS)。L-DP、3-OMD、BSZ的血浆浓度均在50～1000 ng/ml（而C-DP在25～1000 ng/ml）范围内线性关系良好（r值均＞0.99）。L-DP、3-OMD、BSZ最低定量浓度(Lower limitof quantification，LLOQ)均为50 ng/mL，C-DP为25 ng/mL。低、中、高三种浓度质控样品的日内和日间的RSD均小于11％。日内、日间平均准确度在95.7％～105.2％之间。样品多次冻融及在室温下8h，提取后24 h内稳定性良好。本研究所建立的方法，结果准确可重现，可用于L-DP、3-OMD和BSZ或C-DP的药动学研究。
　　在第二章中，考察了18名中国男性健康志愿者多次口服三种左旋多巴制剂给药方案达稳态后血浆中L-DP的药动学特征及生物利用度比较。L-DP的主要药动学参数见下表:┏━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━┓┃┃ Test1┃ Test2┃ Reference┃┣━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━┫┃ Parameters┃(Sinemet CR0.5 tablet+┃(Madopar0.5 tablet+┃(Sinemet CR0.5 tablet)┃┃┃ entacapone1 tablet)┃entacapone1 tablet)┃┃┣━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━┫┃AUC0-t(ng·h/mL)┃3654.6±704.2┃2365.9±597.8┃3156.4±494.51┃┣━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━┫┃AUC0-inf(ng·h/mL)┃4522.2±1334.4┃2917.8±656.1┃3787.7±868.7┃┣━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━┫┃AUCss(ng·h/mL)┃2810.8±555.7┃1859.7±481.5┃2522.3±372.1┃┣━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━┫┃ Cssmax(ng/mL)┃809.6±128.4┃753.6±156.5┃746.8±148.5┃┣━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━┫┃Cssmin(ng/mL)┃218.8±58.2┃101.8±33.6┃123.9±39.94┃┣━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━┫┃ Tmax(h)┃2.53±0.50┃1.43±0.69┃2.19±0.71┃┣━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━┫┃ t1/2(h)┃2.96±1.04┃2.72±1.43┃2.87±1.01┃┣━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━┫┃ DF(％)┃128.8±33.28┃214.0±40.47┃149.4±30.53┃┗━━━━━━━━━━┻━━━━━━━━━━━━━┻━━━━━━━━━━━┻━━━━━━━━━━━━┛
　　以L-DP计，经90％置信区间和双单侧t检验，测试药1:卡左双多巴控释片+恩他卡朋片、测试药2:多巴丝肼片+恩他卡朋片与参比药卡左双多巴控释片的AUC0-t、AUC0-inf、AUCss均生物不等效。L-DP的生物利用度比较结果为:测试药1＞参比药＞测试药2。测试药1:卡左双多巴控释片+恩他卡朋片、测试药2:多巴丝肼片+恩他卡朋片与参比药卡左双多巴控释片的Cssmax均生物等效。测试药1的Tmax与参比药无显著差异(P＞0.05)，测试药2的Tmax与参比药有显著差异(P＜0.05)。参比药的Tmax大于测试药2。
　　经比较三组给药方案的AUC后，以测试药1组的给药方案为最优。即卡左双多巴控释片+恩他卡朋片，每日四次，每次半片卡左双多巴控释片+1片恩他卡朋片;因为从AUC值可看出，卡左双多巴控释片+COMT酶抑制剂恩他卡朋后，可明显提高外周血中L-DP的量（即AUC↑），而L-DP代谢则进一步减少。测试药1组的给药方案，在AUC值和Cssmax值上明显优于测试药2组，药物浓度的波动(DF％)也明显较小（前者为128.8％±33.28％，后者为214.0％±40.47％）。三组给药方案中的Cssmax均生物等效，说明目前临床三种给药方案，使用酶抑制剂并不影响制剂中L-DP的溶出释放，对ssmax大小没有影响。在给药试验中，志愿者没有出现有明显临床意义的不良事件，受试者均较耐受，提示该三种给药方案具有较好的临床安全性和耐受性。
　　在第三章中，采用了直接测序法对以上19名受试者进行COMT G1947A、C1883G和G1966T三个位点的单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）检测。考察了COMT G1947A、C1883G和G1966T位点在受试者中的频率分布，并分析了其中两个位点(G1947A、C1883G)的基因多态性对L-DP及其代谢物3-OMD的主要药动学参数（AUC0-∞、Cssmax、 Tmax）及两者药动学参数比率（AUC0-∞ Ratio、Cssmax Ratio）的影响。本研究发现，COMT G1947A、C1883G两个位点基因分布符合哈迪-温伯格（Hardy-weinberg）平衡定律，样本具有一定的群体代表性。G1966T位点未发现基因突变，均为T/T型。
　　通过基因多态性与药动学参数的相关性研究，结果表明:对于COMT C1883G位点，杂合子(C/G)组与野生型(C/C)组及突变纯合子(G/G)组在L-DP及3-OMD的AUC0-∞，AUC0-∞Ratio(L-DP/3-OMD)数据上均出现显著性差异，提示从临床用药角度而言，COMT基因C/G型携带者可能需要减少L-DP制剂的用量，而G/G型携带者则可能需要增加L-DP制剂的用量。
　　本课题的研究结果有助于临床选择最优的L-DP制剂的给药方案（卡左双多巴控释片半片+恩他卡朋片1片，每日四次），并通过基因多态性分析，探讨临床个体化给药的可能，为PD患者合理使用L-DP类制剂提供了可信的试验依据。

目录

缩写字母表

摘要

前言

参考文献

第一章 左旋多巴、3-氧甲基多巴、苄丝肼或卡比多巴LC-MS／MS法的建立与评价

1 引言

2 仪器与试剂

2．1 实验仪器

2．2 药品与试剂

3 实验方法

3．1 储备液的配制

3．2 工作液的配制

3．3 标准曲线和质控的配制

3．4 样品的预处理

3．5 色谱条件的确立

3．6 质谱条件的确立

4 结果

4．1 分析方法的专属性

4．2 标准曲线回归方程

4．3 最低检测浓度的确定

4．4 最低定量浓度的确定

4．5 精密度和准确度结果

4．6 基质效应的分析

4．7 稳定性试验结果

4．8 稀释试验的结果

5 讨论

6 方法小结

参考文献

第二章 左旋多巴制剂三种给药方案的生物利用度比较试验

1 引言

2 仪器与试药

2．1 实验仪器

2．2 药品与试剂

3 临床研究的实施

3．1 受试者

3．2 试验流程

3．3 给药方法

3．4 血样分析

3．5 药动学参数的计算

3．6 安全性评价

4 临床试验结果

4．1 受试者概况

4．2 药-时曲线和主要药动学参数

4．3 生物利用度评价

4．4 安全性评价

5 讨论

6 小结

参考文献

第三章 COMT基因多态性与L-DP、3-OMD药动学相关性

1 引言

2 仪器与试药

2．1 实验仪器

2．2 提取和测序试剂

3 基因测序过程和方法

3．1 DNA抽提

3．2 PCR扩增

3．3 PCR产物纯化

3．4 PCR产物测序

4 统计分析

4．1 药动学参数

4．2 用SPSS软件进行数据统计

5 结果

5．1 SNP位点的基因分型

5．2 SNP位点基因型及等位基因的频率分布

5．3 SNP位点基因型分布对L-DP及3-OMD药动学参数影响

6 讨论

7 小结

参考文献

结语

致谢

附录1 攻读学位期间发表文章、申请课题和奖励情况

附录2 帕金森氏病的药物治疗进展(综述)

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