家猪干扰素ω及δ基因家族的特征及抗蓝耳病应用研究

摘要

I型干扰素是一种广泛应用于抗病毒,抗肿瘤和免疫调控方面的细胞因子。首先,我们从干扰素的进化入手,讨论了I型干扰素在鱼类、鸟类和哺乳动物中的不同形式。并具体的分析了哺乳动物中I型干扰素各亚型的进化及功能。随后,我们具体分析了从病毒诱导干扰素表达到干扰素发挥抗病毒作用流程中的各个步骤:病毒诱导干扰素的产生,干扰素与受体结合激活下游信号,干扰素激活的信号通路活化干扰素相关基因的表达,干扰素相关基因发挥抗病毒作用等。我们总结了参于此信号通路的具体蛋白分子,并由此进一步分析了病毒通过对这些步骤中的具体环节的作用,从而达到免疫逃逸目的的过程。
　　猪繁殖与呼吸综合症俗称猪蓝耳病,是由猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PPRSV)引起的一种传染性疾病。蓝耳病以妊娠母猪的繁殖障碍(流产、死胎、木乃伊胎)及各种年龄猪特别是仔猪的呼吸道疾病为特征,其危害已几乎遍极世界所有养猪国家。本文简述了猪繁殖与呼吸综合症的流行与危害,PRRSV病毒分类,蛋白结构功能,作用方式及特点等。由于PRRSV病毒作用过程中有强烈的免疫抑制作用,PRRSV的抗病毒药物和疫苗的研究一直是一个难题。我们从免疫和疫苗的角度分析了PRRSV病毒的免疫特点,PRRSV疫苗及存在的问题,PRRSV疫苗佐剂研究的进展等。最后,我们简要叙述了2006-2007在我国等亚洲国家大爆发的高致病性猪蓝耳病及其特点。
　　干扰素ω属于I型干扰素基因家族。利用BLAST的方法,在已有的家猪基因组数据库中搜索,发现了8条家猪干扰素∞功能基因和4条假基因。它们均在家猪1号染色体上。我们利用生物信息学工具分析了它们的基因序列性质及在基因组中的位置。通过序列比对,设计特异性引物从猪的PKl5细胞系基因组中调取干扰素ω各亚型的基因,将其克隆入表达载体pcDNA3.1,转染BHK.21细胞进行表达并检测了所表达各亚型干扰素ω在猪PK15细胞系上的抗病毒等活性。干扰素ω各亚型均具有抗病毒活性,其活性范围大约在10(4)-10(5)左右。抗病毒活性最高的干扰素ω7,其活性大约为活性最低的干扰素ω4的20倍。在用伪狂犬病毒(PRV,pseudorabies virus)和标准干扰素刺激物poly(I).poly(C)的刺激后,分别检测了猪PK15细胞株和外周血单核细胞(PBMC,peripheral blood mononuclear cells)中干扰素ω各亚型的表达情况。结果显示,在病毒和poly(I).poly(C)的刺激后,干扰素ω2/ω6得到了最大量的诱导表达。
　　我们从家猪基因组数据库中发现了11条IFN-6基因和7条假基因,对他们进行了基因组定位和序列,进化分析。并依据进化和序列比对,相似性分析结果,克隆表达了其中3个有代表性的基因并对它们的生物学功能进行了分析。对伪狂犬病毒(PRV)抗病毒实验结果显示:IFN-δ均具有I型干扰素特征性的抗病毒功能,但抗病毒活性的差距很大。通过对IFN-δ抗病毒和免疫调节作用的实验分析,我们发现:IFN-δ可以与I型干扰素受体IFNAR结合,并通过JAK/STAT通路活化信号通路分子STAT,从而诱导抗病毒基因(ISG)的表达,发挥抗病毒作用。并可以通过诱导其它细胞因子表达达到调节免疫系统的作用。但各亚型之间存在较大的差异。
　　家猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)是在世界范围内对畜牧业经济影响很大的一种家猪传染病病毒。由于此病毒的特殊性质,市场上一直缺乏安全有效的疫苗。在本项研究中,我们将家猪IFN-δ8在细胞和动物体上用于抵抗PRRSV攻击,以及在动物体上做为蓝耳病灭活疫苗佐剂抵抗PRRSV攻击。动物实验证明,PoIFN-δ8直接注射家猪同时以PRRSV病毒攻击,保护率可达80％。佐剂与蓝耳病灭活疫苗(killed virus’vaccine,KV)联用,一次免疫注射家猪后28天攻毒,保护率可达80％。PoIFN-δ8可以活化细胞免疫和体液免疫,促进动物体内病毒的清除,防止或减轻动物的病理症状,并可以较大的提高动物在PRRSV病毒攻击后的存活率。本项研究是迄今为止对PoIFN-δ在动物体上抗病毒和疫苗佐剂作用的首次探讨。本项研究为未来应对各种家猪病毒性疾病提供了一个新的可行方向。
　　到目前为止,证明非脊椎动物中存在脊椎动物螺旋细胞因子类似物的证据主要来源于生理生化水平的功能分析,然而缺乏遗传学和分子生物学方面的相关数据。以前的研究表明,利用比较基因组学的分析方法在果蝇的基因组内没有发现任何的细胞因子的同源序列。在本项研究中,我们从GenBank数据库中收集到12种鱼细胞因子的序列信息,利用Hidden Markov Models构建出每种细胞因子的一致性序列:我们进一步利用SMART软件计算得到每条一致性序列的保守区域,将这12条保守区域序列作为模板在果蝇RefSeq蛋白数据库中进行PSI-BLAST、比对分析,最后利用脊椎动物螺旋细胞因子的性质对候选序列进行过滤筛选。通过分析,我们在Drosophila melanogaster中得到了一个蛋白序列,CGl4629(NP-569881),它与鱼M17在氨基酸序列N端的101个残基存在25％一致性和46％相似性。进一步分析表明,CGl4629属于DUFl397蛋白质家族,存在DUFl397特异性的保守序列,该家族的蛋白均为血淋巴细胞分泌的糖基化蛋白,并能够在昆虫脂肪体(fat body)中合成。根据以上分析,并考虑到M17与LIF/CNTF的同源性并且Dome受体与LIFR/CNTFR的同源性,我们认为CGl4629是非脊椎动物中LIF/CNTF/M17螺旋细胞因子的类似物,它为寻找非脊椎动物中螺旋细胞因子的存在的证据提供了进化和序列方面的帮助。