TRAIL及受体在少突胶质细胞发育中的表达及在诱导OPC凋亡中的作用

摘要

早产儿脑白质损伤是导致早产儿死亡和神经系统后遗症的重要原因，严重危害早产儿的生存质量，目前尚缺乏有效的防治措施。少突胶质细胞的前体细胞(OPC)是早产儿脑白质损伤的主要靶细胞，凋亡是OPC死亡的主要形式。死亡受体途径是OPC的凋亡的主要途径;该途径由肿瘤坏死因子超家族介导。肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(Tumour necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)是肿瘤坏死因子超家族中的一员，近年来研究发现TRAIL及其受体在正常细胞广泛表达，并参与细胞的存活和免疫监视，因而备受关注。该受体在神经系统中的研究主要集中在脱髓鞘疾病，目前尚缺乏TRAIL受体表达调控对少突胶质细胞保护作用的研究，也缺少TRAIL及其受体在发育中脑白质损伤中的作用的研究报道。因此，进一步探索TRAIL及其受体在少突胶质细胞发育中的作用，以及调控TRAIL受体对少突胶质细胞的保护作用，将有助于我们更好的理解早产儿脑白质损伤的发病机制，为更有效地防治早产儿脑损伤提供新的思路。
　　第一部分人少突胶质系细胞体外扩增培养及分化鉴定
　　应用条件限定培养基培养方法对人少突胶质前体细胞株(HOPC)进行培养。通过免疫组织化学方法培养细胞的进行鉴定。人少突胶质祖细胞PDGFRα荧光标记阳性，人前少突胶质细胞O4荧光标记阳性，人未成熟少突胶质细胞O1荧光标记阳性，成熟少突胶质细胞MBP荧光标记阳性。通过流式细胞术对培养细胞的纯度进行鉴定，少突胶质祖细胞组中PDGFRα(+)/O4(-)细胞的百分比为97.06％;前少突胶质细胞组中O4(+)/O1(-)细胞的百分比为96.01％;未成熟少突胶质细胞组中O4(+)/O1(+)细胞的百分比为95.3％;成熟少突胶质细胞组中MBP(+)细胞的百分比为91.6％。我们选用的HOPCs具有少突胶质祖细胞形态学和生物学特点;通过不同的条件限定培养基，HOPCs可以分化为前少突胶质细胞、未成熟少突胶质细胞和成熟少突胶质细胞;通过此方法可获得高纯度的少突胶质祖细胞、前少突胶质细胞、未成熟少突胶质细胞和成熟少突胶质细胞。
　　第二部分 TRAIL及受体在少突胶质细胞发育中的表达及作用
　　既然我们获得了高纯度的少突胶质祖细胞、前少突胶质细胞、未成熟少突胶质细胞和成熟少突胶质细胞，通过RT-PCR及Western blot2种方法，分别从mRNA水平和蛋白水平检测4组处于不同发育阶段中的人少突胶质细胞表面TRAIL及其受体的表达情况。在不同发育阶段的4组人少突胶质细胞上均未检测到TRAIL的表达，但是4组细胞的表面均可检测到TRAIL受体的表达。不同发育阶段的人少突胶质细胞表面的TRAIL受体的表达存在差异性。TRAIL-R1和TRAIL-R2在人少突胶质祖细胞及前体细胞呈现出高表达性;而TRAIL-R3和TRAIL-R4则主要表达在未成熟少突胶质细胞和成熟少突胶质细胞的表面。再分别给予不同发育阶段的4组人少突胶质系细胞以不同浓度的重组可溶性TRAIL刺激后（2 ng/ml;20 ng/ml;200 ng/ml及2000 ng/ml），通过流式细胞术(AnnexinV-FITC和PI)观察细胞的凋亡情况。随着TRAIL浓度的增加，各组细胞的凋亡率呈现逐渐增加的趋势;TRAIL对少突胶质系细胞的损伤作用呈现明显的量一效关系和成熟依赖性。TRAIL主要诱导少突胶质祖细胞和前少突胶质细胞凋亡。TRAIL诱导少突胶质系细胞的凋亡主要发生在TRAIL刺激后的24-48 h。
　　第三部分下调DR4/DR5，上调DcR1/DcR2对OPC的保护作用
　　我们发现TRAIL受体在少突胶质细胞发育过程中的表达存在差异，TRAIL诱导少突胶质系细胞的凋亡呈现量-效关系和成熟依赖性。于是我们进一步探索调控TRAIL受体是否对OPC具有保护作用。采用小分子siRNA干扰下调少突胶质祖细胞上的TRAIL-DR4/DR5的表达;采用pcDNA3.1慢病毒包埋上调少突胶质祖细胞上的TRAIL-DcR1/DcR2的表达。分别给予siRNA-DR4组、siRNA-DR5组、pcDNA3.1-DcR1组和pcDNA3.1-DcR2组细胞，4组细胞以不同浓度的重组可溶性TRAIL（2 ng/ml;20 ng/ml;200 ng/ml及2000 ng/ml）刺激后，通过流式细胞术观察各组细胞的凋亡情况。在siRNA-DR4组和pcDNA3.1-DcR2组，TRAIL介导其发生凋亡的百分比明显下降，且差异具有显著性。TRAIL介导细胞凋亡主要发生在TRAIL干预后的24 h-48 h。

目录

英文缩略词表

摘要

前言

第一部分 人少突胶质系细胞体外扩增培养及分化鉴定

材料与方法

结果

讨论

小结

第二部分 TRAIL及受体在少突胶质细胞发育中的表达及作用

材料和方法

结果

讨论

小结

第三部分 下调DR4／DR5和上调DcR1／DcR2对OPC的保护作用

材料与方法

结果

讨论

小结

全文总结

课题的创新性、意义以及局限性

参考文献

综述 TRAIL及其受体在中枢神经系统中的研究进展

待发表的文章、参加会议以及获奖情况

致谢

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