P物质小干扰RNA在变应性鼻炎基因治疗中的作用机制研究

摘要

变应性鼻炎(Allergic rhinitis,AR)又称过敏性鼻炎,是耳鼻喉科常见病、多发病,人群发病率高达5-15％,严重影响患者的生活质量。目前研究表明,变应性鼻炎发病中存在多种基因的异常表达,其中,P物质(Substance P,SP)基因的异常表达与变应性鼻炎严重程度密切相关。
　　调节异常致病基因的表达是治疗基因相关疾病的重要途径,而近年来逐渐兴起的小干扰RNA技术则为这类疾病的基因治疗提供了很好的技术支持。小干扰RNA技术主要是通过设计同目的基因mRNA相对应,长度为21-25bp的短RNA序列,以双链的dsRNA或shRNA的形式导入细胞,导入的dsRNA可被Dicer酶消化生成siRNA,或shRNA表达产生针对目的mRNA的特异序列的siRNA,siRNA进一步同目的mRNA及核酸酶结合形成完全的RNA沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC),激活并降解目的mRNA,抑制该基因在细胞内的表达。siRNA技术作为一种高效、特异抑制靶基因表达的方法,既可以用来对目的基因进行功能研究,亦可作为疾病基因治疗的手段。
　　为了研究P物质在变应性鼻炎发病中的作用并探讨SP基因治疗在变应性鼻炎治疗中的作用,我们利用siRNA技术,分别在细胞水平和动物整体水平对P物质siRNA(SP-siRNA)在变应性鼻炎的作用进行研究探讨。
　　我们首先对人,大鼠,小鼠的P物质mRNA序列进行对比分析并使用Whitehead Institute for Biomedical Research的siRNA设计软件设计针对P物质mRNA保守区域的siRNA序列共3条。为验证设计序列的有效性,我们选取变应性疾病研究中常用的肥大细胞-RBL-2H3细胞为对象,进行P物质siRNA干预研究。我们首先通过real time PCR、细胞免疫荧光的方法证明肥大细胞RBL-2H3中存在有内源性P物质表达,并发现P物质的表达在外源DNP-IgE激活后表达增加;针对软件设计的3组P物质siRNA序列,我们使用siRNA研究中广泛应用的shRNA表达载体psilencer 4.1 CMV neo,合成并构建了对应的3组P物质shRNA表达载体及1组阴性对照shR/NA(Negative control-shRNA,NC-shRNA)表达载体,通过克隆扩增,制备并抽提4组shRNA质粒;通过细胞电转化的方法,分别将3组shRNA以及阴性对照shRNA瞬时转染入肥大细胞RBL-2H3;同时对shRNA载体转化后的细胞和转染空载体的细胞使用DNP-IgE刺激,通过real time-PCR及细胞免疫荧光的方法,检测IgE刺激后,肥大细胞RBL-2H3内P物质表达情况,筛选出干扰效果最佳的SP-shRNA2载体作为最佳的转染载体,对应的序列为高效的P物质小干扰RNA序列。对SP-shRNA2、阴性对照NC-shRNA转染后的肥大细胞RBL-2H3,通过β-hexosaminidase实验检测不同shRNA质粒转染对肥大细胞RBL-2H3脱颗粒能力的影响。结果发现,与对照shRNA转染组相比,转染P物质shRNA后,肥大细胞RBL-2H3脱颗粒释放β-hexosaminidase水平降低,说明P物质shRNA作用后可显著抑制肥大细胞RBL-2H3的脱颗粒能力。
　　依照细胞实验结果,我们选取对P物质mRNA抑制表达效率最高的shRNA2序列,依照其对应的siRNA序列合成化学修饰的P物质siRNA(SP-siRNA),给予变应性鼻炎小鼠鼻腔给药,进行动物整体水平的小干扰RNA治疗研究。我们将BABL/C小鼠分别分为:
　　1)变应性鼻炎SP-siRNA干预组;
　　2)变应性鼻炎阴性对照siRNA干预组(Negative control-siRNA,NC-siRNA);
　　3)变应性鼻炎未干预组。
　　对模型小鼠分别进行4次的腹腔注射致敏后,按照siRNA鼻腔给药干预/OVA鼻腔激发/OVA鼻腔激发/OVA鼻腔激发的顺序依次进行干预和激发操作,共进行4次干预,最后一次鼻腔激发后,麻醉小鼠并提取血清、收集鼻黏膜样本。分别通过ELISA,免疫组化,病理染色,real time RT-PCR,抗体芯片等方法检测P物质siRNA干预后,动物鼻腔鼻黏膜局部P物质表达、嗜酸性粒细胞浸润、嗜酸性颗粒释放及变应性鼻炎相关炎症因子的表达情况。结果发现,P物质siRNA干预后,小鼠鼻黏膜中P物质mRNA含量较阴性对照siRNA处理组和生理盐水对照组显著减少,在鼻黏膜局部SP基因表达下降达70％;免疫组化也表明SP-siRNA干预组鼻黏膜中P物质含量明显降低;小鼠变应性鼻炎症状观测发现SP-siRNA可明显改善小鼠鼻炎症状;病理学染色(嗜酸性粒细胞染色)发现P物质siRNA干预后,鼻黏膜中嗜酸性颗粒释放及嗜酸性粒细胞浸润数量减少;同时鼻黏膜总蛋白抗体芯片检测表明,SP-siRNA干预可显著减少鼻黏膜局部IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-6、Eotaxin、Eotaxin-2、CD30L等多种炎性细胞因子的分泌,而鼻腔给予SP-siRNA并未影响AR模型小鼠血清中IgE含量。说明P物质sirNA鼻腔给药可减轻鼻黏膜局部变应性炎症反应。
　　实验证明P物质siRNA能阻断变应性鼻炎的发病过程,SP-siRNA通过抑制肥大细胞RBL-2H3中P物质表达,抑制肥大细胞脱颗粒反应,减少多种变应性鼻炎相关炎症因子的释放;变应性鼻炎小鼠鼻腔SP-siRNA给药抑制鼻黏膜局部P物质表达后,可抑制鼻黏膜局部嗜酸性粒细胞浸润,减少鼻黏膜局部IL-4、IL-6、嗜酸性粒细胞趋化因子等多种炎症因子的分泌,抑制鼻黏膜局部变应性炎症反应,缓解变应性鼻炎症状。实验提示P物质siRNA干预可能是具有治疗前景的变应性鼻炎的基因治疗有效方法。