结核分枝杆菌Mtb9.9家族蛋白免疫功能的研究

摘要

结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，简称为M.tb）引起的一种慢性传染病。据世界卫生组织(WHO)统计，当前全球约有1/3的人感染了结核杆菌，每年死于结核病的人数达到300万。随着耐药结核的增加和HIV共感染，结核病成了危害人类健康的重要传染病之一。要控制结核病的流行与蔓延的关键在于弄清楚结核的耐药机制、有效地疫苗保护、早期诊断以及规范的多药物联合的化学治疗。目前广泛使用的唯一结核疫苗BCG的保护效果不理想，迫切需要新型结核疫苗的开发，另外改良的诊断试剂对于检测结核分枝杆菌感染是必须的，研究新的血清学诊断方法是对现有诊断方法的一个有力补充。
　　定量蛋白质组学(quantitative proteomics)是研究结核耐药机制、找到新的疫苗和诊断候选蛋白的有力工具。我们利用定量蛋白质组学的相对和绝对定量的等量异位标签技术(Isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation，iTRAQ)研究了两株临床分离的广泛耐药结核(extensively drug resistant tuberculosis，XDR-TB)和标准株H37Rv之间的差异蛋白表达。发现Mtb9.9c蛋白在两株XDR-TB中分别上调表达了1.7和21.3倍。Mtb9.9c蛋白是Mtb9.9家族中的一员。这是一组由94个氨基酸组成的相对分子质量为9.9kDa的蛋白家族，H37Rv株的Mtb9.9家族主要由Mtb9.9a(Rv1793)、Mtb9.9c(Rv1198)、Mtb9.9d(Rv1037c)和Mtb9.9e(Rv2346c)基因编码，其序列相互间具有高度同源性，本论文以这一家族蛋白为研究对象，探索了Mtb9.9家族蛋白作为亚单位疫苗和诊断抗原的潜力。
　　本文成功地在大肠杆菌(Escherichia coli， E.coli)中克隆、表达和纯化了Mtb9.9家族蛋白。将重组蛋白和弗氏不完全佐剂(IFA)联合免疫C57BL/6小鼠，在第三次免疫后的第三周，收集小鼠血清和脾细胞进行Western Blot、细胞免疫和体液免疫检测。结果显示Mtb9.9家族蛋白之间有相似和特异的抗原表位。我们用Elispot发现了免疫小鼠产生IFN-γ的脾细胞数量增多。Elisa检测到细胞因子IFN-γ、TNF-α的分泌量比对照多，但IL-4几乎没有变化。上述结果说明了Mtb9.9家族蛋白主要诱导Th1型细胞免疫。体液免疫检测了小鼠免疫后血清中IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG2c的抗体水平，发现Mtb9.9家族蛋白能诱导小鼠产生强烈的体液免疫应答，说明这是一组免疫原性抗原。另外IgG2c和IgG2b的产生量都比IgG1多，进一步证实了Mtb9.9家族蛋白诱导以Th1型为主的细胞免疫。
　　为了进一步评估Mtb9.9家族蛋白的诊断潜力，我们克隆、表达、纯化了CFP-10蛋白做为血清学诊断的对照蛋白，来检测Mtb9.9家族蛋白针对结核病人血清以及接种BCG的健康对照者(n=61)血清的抗体反应。结核病人血清包括全敏肺结核病人的血清(n=101)、肺外结核病人(n=10)和多耐药病人血清(n=60)。结果显示在诊断耐多药病人血清方面，Mtb9.9a蛋白的敏感性可以达到75％，比对照CFP-10蛋白的敏感性53.3％要高，但是它的特异性为83.6％，略低于对照CFP-10蛋白的88.5％。研究中还发现，重组Mtb9.9a蛋白针对接种BCG的健康对照者和耐多药结核病人的血清学反应具有显著的差异(p＜0.0001)。证明了Mtb9.9a蛋白具有用于耐多药结核病人的血清学诊断的潜力。这一结果在文献检索中未见报道。
　　综上所述，Mtb9.9家族蛋白主要介导Th1型细胞免疫，具有作为亚单位疫苗的应用潜力。另外Mtb9.9a蛋白可以区别耐多药病人和健康对照，有希望作为耐多药结核病人的血清学诊断的候选抗原。

目录

缩略语表

摘要

第一章 结核病的现状及研究进展

第一节 结核病现状

第二节 结核分枝杆菌耐药现状和机制

第三节 定量蛋白质组学在结核杆菌研究中的应用

第四节 结核分枝杆菌诊断抗原的研究进展

第五节 Mtb9．9家族蛋白的研究进展

参考文献

第二章 XDR定量蛋白质组学研究及Mtb9．9家族蛋白的信息学分析

第一节 前言

第二节 材料与方法

第三节 实验结果

第四节 讨论

参考文献

第三章 基因工程技术制备Mtb9．9家族重组蛋白

第一节 实验材料和试剂

第二节 实验方法

第三节 实验结果

第四节 讨论

第四章 Mtb9．9家族蛋白细胞免疫和体液免疫特性的研究

第一节 实验材料和试剂

第二节 实验方法

第三节 实验结果

第四节 讨论

参考文献

第五章 Mtb9．9家族蛋白在血清学诊断中的应用潜力分析

第一节 材料和试剂

第二节 实验方法

第三节 实验结果

第四节 讨论

参考文献

全文总结与展望

附图1 (mtb9．9a)Rv1793插入pET28a质粒后测序结果

附图2 (mtb9．9c)Rv1198插入pET28a质粒后测序结果

附图3 (mtb9．9d)Rv1037c插入pET28a质粒后测序结果

附图4 (mtb9．9e)Rv2346c插入pET28a质粒后测序结果

博士在读期间的主要工作成果

致谢

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