基于LyP-1介导淋巴转移肿瘤靶向的脂质体递药系统研究

摘要

淋巴转移是肿瘤转移的一种重要形式，也是肿瘤患者预后的一个重要标志。目前转移肿瘤的治疗方法主要是手术治疗加常规化疗，但手术治疗难以将所有转移肿瘤清除干净，而常规化疗往往导致严重的毒副作用。因此，一种有效的针对淋巴转移肿瘤的靶向递药系统将会有助于提高对其治疗效果，因而具有重要的现实意义。脂质体因其皮下注射后可自动导向淋巴系统并被淋巴结摄取而被广泛用作淋巴系统靶向递药载体，但其因对肿瘤转移淋巴结缺乏靶向性而限制了其在淋巴转移肿瘤靶向递药方面的应用。在肿瘤的淋巴转移过程中，淋巴结内的肿瘤淋巴管和肿瘤相关巨噬细胞发挥了关键作用。LyP-1是一个环状九肽，被证明能与特定肿瘤细胞、肿瘤淋巴管和肿瘤相关巨噬细胞发生特异性结合。因此，本论文拟制备一种LyP-1修饰的脂质体递药系统用于向淋巴转移肿瘤靶向递药，旨在提高脂质体所包载化疗药物对淋巴转移肿瘤的靶向性和治疗效果，并通过破坏肿瘤淋巴管和肿瘤相关巨噬细胞而抑制肿瘤的淋巴转移。
　　第一章，合成了LyP-1并构建了LyP-1修饰的脂质体递药系统。采用固相多肽合成技术合成了LyP-1并进行荧光标记，采用高效液相色谱法和质谱法对其进行了结构表征;利用巯基和马来酰亚胺的特异性反应和碘氧化的方法合成功能性脂质体膜材料LyP-1-PEG-DSPE，并采用HPLC、1H-NMR和FTIR等手段对其进行了结构表征;采用成膜水化-挤压过膜法制备了LyP-1修饰的分别包载阿霉素(DOX)、5-羧基荧光素(FAM)和近红外染料DiR的PEG化脂质体，并对其粒径及分布、外观形态、包封率和内容物泄漏等性质进行了表征。结果显示，荧光标记LyP-1和LyP-1-PEG-DSPE均合成成功;制备的脂质体粒径为90nm左右、分布均匀，符合淋巴靶向载体要求，透射电镜和原子力显微镜表征结果显示，阿霉素脂质体外观圆整，为球形或类球形粒子，各种脂质体的内容物泄漏率均符合要求，LyP-1修饰对脂质体理化性质均无明显影响。
　　第二章，对LyP-1和LyP-1修饰脂质体的体内外靶向性进行了研究。采用细胞摄取试验研究了LyP-1对MDA-MB-435黑色素瘤、SPC-A1肺腺癌、NCI-H292肺癌、BxPC-3胰腺癌等四种肿瘤细胞的体外靶向性;采用近红外活体成像技术研究了LyP-1对MDA-MB-435黑色素瘤转移淋巴结的体内靶向性;采用细胞摄取试验对LyP-1修饰的PEG化脂质体(L-P-LS)对MDA-MB-435、SPC-A1、NCI-H292、BxPC-3四种细胞的体外靶向性进行了研究;通过向裸鼠后足垫皮下接种MDA-MB-435、NCI-H292、SPC-A1和绿色荧光蛋白(GFP)标记的SPC-A1细胞，构建了淋巴转移肿瘤动物模型，并在MDA-MB-435、NCI-H292、SPC-A1三种肿瘤淋巴转移动物模型上验证了L-P-LS对淋巴转移肿瘤的体内靶向性。结果显示，LyP-1能特异性被四种肿瘤细胞和肿瘤转移淋巴结摄取，显示了良好的体内外靶向性;L-P-LS对四种肿瘤细胞显示了良好的体外靶向性;MDA-MB-435黑色素瘤和NCI-H292肺癌动物模型的淋巴结病理切片显示，肿瘤接种侧的腘、髂淋巴结中形成肿瘤转移灶，未接种侧淋巴结和其他脏器中未见转移灶;SPC-A1肺腺癌动物模型显示，所有淋巴结未见明显转移灶，但在GFP标记的SPC-A1肺腺癌动物模型肿瘤接种侧的腘、髂淋巴结中具有明显的散在肿瘤细胞分布;体内靶向性研究显示，L-P-LS对MDA-MB-435黑色素瘤、NCI-H292肺癌和SPC-A1肺腺癌的淋巴转移肿瘤均显示出良好的靶向性。
　　第三章，对LyP-1修饰的载阿霉素脂质体的体内外抗肿瘤细胞和淋巴转移肿瘤的药效评价。采用MTT法研究了L-P-LS/DOX对MDA-MB-435、SPC-A1、NCI-H292肿瘤细胞的体外生长抑制作用;采用MDA-MB-435黑色素瘤和SPC-A1肺腺癌淋巴转移肿瘤动物模型对L-P-LS/DOX抗淋巴转移肿瘤药效进行了评价。结果显示，LyP-1的修饰增加了阿霉素脂质体对肿瘤细胞的体外生长抑制效果;MDA-MB-435黑色素瘤动物模型的药效学结果表明，与P-LS/DOX相比，L-P-LS/DOX对腘、髂淋巴结转移肿瘤显示出更显著的抑制效果，并且降低了腘、髂淋巴结肿瘤转移率;对SPC-A1肺腺癌动物模型的药效学结果显示，P-LS/DOX只对腘淋巴结转移肿瘤有明显抑制效果，而L-P-LS/DOX对腘、髂淋巴结转移肿瘤均表现出明显抑制效果。
　　第四章，对LyP-1修饰的载阿霉素脂质体的体内外安全性进行了考察。采用MTT法研究了L-P-LS和P-LS空白脂质体对MDA-MB-435、SPC-A1和NCI-H292细胞的体外毒性;考察了多次足垫注射L-P-LS/DOX和P-LS/DOX对大鼠的足垫组织损伤和对裸鼠的心脏毒性。结果显示，空白L-P-LS和P-LS未现明显细胞毒性;DOX对大鼠注射部位造成了严重的组织坏死，而P-LS/DOX和L-P-LS/DOX只表现为轻微水肿;DOX导致了裸鼠心脏心肌细胞变性、心肌纤维溶解，而P-LS/DOX和L-P-LS/DOX未表现出明显心脏毒性。
　　第五章，探讨了LyP-1修饰脂质体对淋巴转移肿瘤的靶向机理和药效机理。采用免疫荧光染色方法验证了LyP-1对肿瘤转移淋巴结内淋巴管的亲和性;采用近红外活体成像技术考察了L-P-LS和P-LS被正常淋巴结的摄取;采用GFP标记的NCI-H292细胞构建了淋巴转移肿瘤动物模型，并在此基础上考察了L-P-LS与淋巴结内肿瘤转移灶的亲和性;采用免疫荧光染色法研究了L-P-LS对MDA-MB-435黑色素瘤和SPC-A1肺腺癌肿瘤转移淋巴结内淋巴管和肿瘤相关巨噬细胞的亲和性;利用免疫荧光染色法定量多次给药后淋巴结内淋巴管密度来探讨L-P-LS/DOX发挥抗淋巴转移肿瘤药效的机理。结果显示，LyP-1可与淋巴结中肿瘤淋巴管特异性结合;LyP-1的修饰对正常淋巴结摄取脂质体行为几乎无影响，表明LyP-1的修饰不影响脂质体的非特异性摄取;L-P-LS可特异性地分布在GFP标记的NCI-H292肺癌肿瘤转移灶周围，而P-LS未显示此特性;L-P-LS被转移淋巴结摄取后，可特异性地与肿瘤淋巴管和肿瘤相关巨噬细胞结合;与P-LS/DOX相比，L-P-LS/DOX能显著降低腘淋巴结中淋巴管密度，提示L-P-LS/DOX可通过破坏肿瘤淋巴管、降低淋巴管密度来抑制肿瘤淋巴转移。
　　综上所述，本论文成功构建了一种LyP-1修饰的用于淋巴转移肿瘤靶向递药的脂质体递药系统。经组织间隙给药后对淋巴转移肿瘤显示了良好的靶向性和抑制效果，其对淋巴转移肿瘤的靶向和抑制机理可能通过对转移肿瘤灶、肿瘤淋巴管和肿瘤相关巨噬细胞的特异亲和性而实现。LyP-1修饰的脂质体递药系统是一种具有潜在应用价值的用于淋巴转移肿瘤治疗的主动靶向递药系统。

目录

摘要

英文缩略语注释

前言

1．研究意义

2．研究背景

2．1 淋巴靶向的生理学基础

2．2 淋巴系统靶向递药系统

2．3 淋巴管新生与肿瘤转移关系

2．4 肿瘤相关巨噬细胞与肿瘤转移关系

2．5 LyP-1短肽功效

3．课题设计和研究内容

3．1 研究思路及目的

3．2 研究内容

参考文献

第一章 LyP-1多肽合成及LyP-1修饰脂质体递药系统的构建

第一节 LyP-1多肽的合成和荧光标记

1．材料与仪器

2．方法

3．结果与讨论

4．小结

第二节 LyP-1-PEG-DSPE的合成及表征

1．材料与仪器

2．方法

3．结果与讨论

4．小结

第三节 LyP-1-PEG-脂体递药系统的构建及表征

1．材料与仪器

2．方法

3．结果与讨论

4．小结

本章小结

本章结论

参考文献

第二章 LyP-1和LyP-1-PEG-脂质体的体内外靶向性评价

第一节 LyP-1体外靶向活性的考察

1．材料与仪器

2．方法

3．结果与讨论

4．小结

第二节 LyP-1体内靶向活性的考察

1．材料与仪器

2．方法

3．结果与讨论

4．小结

第三节 LyP-1-PEG-脂质体的体外靶向性评价

1．材料与仪器

2．方法

3．结果与讨论

4．小结

第四节 LyP-1-PEG-脂质体的体内靶向性评价

1．材料与仪器

2．方法

3．结果与讨论

4．小结

本章小结

本章结论

参考文献

第三章 LyP-1-PEG-脂质体／阿霉素的药效评价

第一节 LyP-1-PEG-脂质体／阿霉素的体外药效评价

1．材料与仪器

2．方法

3．结果与讨论

4．小结

第二节 LyP-1-PEG-脂质体／阿毒素的体内药效评价

1．材料与仪器

2．方法

3．结果与讨论

4．小结

本章小结

本章结论

参考文献

第四章 LyP-1-PEG-脂质体／阿霉素的安全性考察

第一节 LyP-1-PEG-脂质体膜材料的细胞毒性考察

1．材料与仪器

2．方法

3．结果与讨论

4．小结

第二节 LyP-1-PEG-脂质体／阿霉素的组织损伤考察

1．材料与仪器

2．方法

3．结果与讨论

4．小结

本章小结

本章结论

参考文献

第五章 LyP-1-PEG-脂质体的靶向及药效机理探讨

第一节 LyP-1的靶向机理探讨

1．材料与仪器

2．方法

3．结果与讨论

4．小结

第二节 LyP-1-PEG-脂质体的靶向机理探讨

1．材料与仪器

2．方法

3．结果与讨论

4．小结

第三节 LyP-1-PEG-脂质体的药效机理探讨

1．材料与仪器

2．方法

3．结果与讨论

4．小结

本章小结

本章结论

参考文献

全文结论与展望

论文创新性

博士期间发表或拟发表的论文和专利

致谢

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