重组SCYL1-BP1基因工程菌株的构建及其表达条件的研究

摘要

SCYL1-BP1是本实验室通过酵母双杂交技术，首先从人胎盘cDNA文库中克隆得到的一个能与SCYL1相互作用的新基因。前期的研究结果发现，该蛋白主要分布在核内，少量分布于核周和胞浆中。该基因转染细胞后能显著抑制肝癌细胞株的生长与集落形成，同时具有显著抑制荷瘤裸鼠的肿瘤形成的作用。该基因过表达时会延长细胞在G2-M期的停留时间，抑制细胞生长。该基因过表达能稳定P53蛋白免于被MDM2介导的泛素化途径降解。基因表达谱芯片检测发现当该基因被RNAi抑制时，可以引起NFκB的表达上调。相关文献报道表明，NFκB的过度激活可以引发肿瘤。结果提示，SCYL1-BP1基因具有细胞周期调控功能，并具有肿瘤抑制因子的特性。
　　为了获得足够量的纯化SCYL1-BP1蛋白以便用于进行新药安全性检测和一系列药理学实验，我们拟采用基因工程技术将该蛋白大量表达。为此本论文分为两个部分，第一部分是关于SCYL1-BP1以大肠杆菌为宿主的原核工程菌株构建及后期蛋白鉴定纯化，第二部分是关于SCYL1-BP1在真核毕赤酵母中的克隆构建以及后期的蛋白分离鉴定。
　　在论文的第一部分中，我们首先将SCYL1-BP1基因克隆到高效表达载体pET-28b-sumo上，构建了原核表达重组载体pET-28b-sumo-SCYL1BP1，后转入大肠杆菌表达宿主菌中，构建了原核表达系统。为了使得重组蛋白SCYL1-BP1大量表达，我们摸索了宿主菌种的选择、IPTG诱导浓度、诱导培养时间、接种量等条件的选择。以期获得重组蛋白的大量表达。但经过培养条件以及诱导条件的摸索，结果发现重组蛋白SCYL1-BP1在大肠杆菌这一原核表达系统中表达效果欠佳，并不能达到预期大量表达的效果。
　　为此，我们进行了重组蛋白SCYL1-BP1的真核表达系统的构建。在论文的第二部分中，我们根据SCYL1-BP1蛋白的氨基酸序列，同时考虑到毕赤酵母的密码子偏爱性，设计引物，通过重叠PCR的方法，合成了适合在毕赤酵母中表达的全长SCYL1-BP1基因序列，并将其克隆到毕赤酵母表达载体pHBM905A上，转化毕赤酵母GS115菌株，从而构建了重组蛋白SCYL1-BP1毕赤酵母真核表达系统。重组毕赤酵母菌株在BMGY中28℃，250 rpm培养48h后，转接进入BMMY培养基中，进行26℃，250rpm培养，期间每隔24h向其中加入1％甲醇。培养。SDS-PAGE结果显示50-60kDa区间有特异性条带，初步表明外源蛋白在毕赤酵母中成功表达。

目录

摘要

第一部分 SCYL1-BP1蛋白的原核表达及初步分离鉴定

一、、前言

二、材料与方法

三、结果

1．克隆构建

2．蛋白表达

四、讨论

五、小结

参考文献

第二部分 SCYL1-BP1蛋白的真核表达及初步分离鉴定

一、前言

二、材料与方法

三、结果

1．设计合成全长毕赤SCYL1-BP1基因的引物

2．Overlapping PCR法合成全长毕赤SCYL1-BP1基因

3．Muts蛋白纠正及变性SDS-PAGE检测

4．T4 DNA聚合酶处理

5．载体pHBM905A CpoⅠ和NotⅠ酶切

6．连接转化及阳性克隆的初步筛选

7．煮菌阳性结果进行测序

8．第二轮Overlapping PCR

9．线性化质粒

10．脱磷酸处理

11．酵母电击转化

12．外源基因在毕赤酵母中的摇瓶诱导表达

四、讨论

五、小结

参考文献

总结

大肠杆菌和酵母菌在表达重组蛋白方面的比较

致谢

声明