CIC-2对慢性颞叶癫痫大鼠海马CA1区α5亚基-GABAAR介导紧张性抑制的影响

摘要

颞叶癫痫是一组以反复癫痫发作、学习记忆功能减退为主要临床表现的疾病。以往的研究表明，它与海马局部神经元退行性变、胶质增生、异常环路重构以及脑内兴奋-抑制作用失衡有关。在成年动物中枢神经系统中，GABA作为主要的抑制性神经递质，通过GABA-R起作用。其中，GABAAR主要通过介导C1-内流引起细胞超极化而发挥抑制作用。根据GABAAR的分布和激活后的电生理特性，可以将GABAAR粗略地分成两大类：synaptic GABAAR和extrasynapticGABAAR，前者介导GABAergic的时相性抑制(phasic inhibition)，后者介导GABAergic的紧张性抑制(tonic inhibition)。近年来，extrasynaptic GABAAR介导的紧张性抑制吸引了越来越多学者的关注。但无论是时相性还是紧张性抑制，均依赖于神经元内低氯状态。
　　 有研究表明，GABAAR激活后，氯离子内流和碳酸氢根离子外流是相藕联的，由于碳酸酐酶的作用可维持细胞内碳酸氢根离子的高浓度，所以，碳酸氢根离子可持续的顺浓度梯度大量外流，同时，氯离子亦大量内流，从而介导突触后抑制作用。如果氯离子在短时间内不能有效排出细胞外，以保持细胞内的低氯环境，反复激活GABAAR会引起细胞内氯离子超载，后者可增加氯离子内流的阻抗，使突触后抑制作用明显减弱。因此，向胞外转运氯离子的能力对于维持神经元正常的GABAergic抑制作用显得尤为重要，氯离子稳态的打破有可能参与了异常放电的形成，而并非仅仅是异常放电的结果。细胞内外氯离子的浓度梯度主要是由一组阳离子-氯离子同向转运体和氯通道共同调节。C1C-2是电压门控性氯通道中的一种，参与调节细胞内外氯离子浓度、维持细胞膜电位等。已有研究表明，在癫痫模型中，作为成熟神经元上主要的氯离子外向转运体KCC2明显下调。考虑到C1C-2本身的特性，即在膜内电位低于膜平衡电位时被激活，产生内向整流，电导大，且该通道的失活无明显时间依赖性。那么，在癫痫病理状态下，C1C-2有何改变？
　　 Rinke用C1C-2基因敲除小鼠证实，在细胞内高氯的状态下，C1C-2有一定的外向转运氯离子的作用，且承担了相当一部分的背景电导以维持膜电位的稳定，但野生型和基因敲除小鼠的mIPSP、sIPSP和PPR均没有显著性差异，说明C1C-2与GABAAR介导的时相性抑制无关。有研究表明，在成年动物海马CA区，GABAergic的紧张性抑制主要是由α5亚基-GABAAR介导。我们要研究的问题是：C1C-2是否与α5亚基-GABAAR介导紧张性抑制有关？即药物阻断α5亚基-GABAAR是否引起C1C-2电流的改变？在癫痫病理状态下，C1C-2电流有何改变？α5亚基-GABAAR介导的紧张性抑制本身有何改变？这种改变对大鼠慢性期SRS发作有何影响？在体阻断α5亚基-GABAAR能否改善大鼠海马的突触可塑性？
　　 第一部分匹罗卡品致病大鼠的行为学特征及海马神经元损伤的表现
　　 目的：观察匹罗卡品致痫大鼠的行为学特征及海马CA1区神经元损伤的情况。
　　 方法：雄性SD大鼠(180-200g)随机分成对照组、致痫组，为了解大鼠致痫后不同时期的行为学特征、海马神经元的损伤情况以及目的蛋白表达的变化，根据致痫后自然病程的长短，将致痫组分为：急性期组(致痫后24小时)、潜伏期组(致痫后5天)、慢性期组(出现SRS后14天)和晚期组(出现SRS后30天)。致痫组给予匹罗卡品(340mg/kg，i.p.)致痫，致痫前30min给予阿托品(5mg/kg，i.p.)减轻外周胆碱能作用。如果首剂匹罗卡品注射一小时后仍没有点燃，可以追加一次匹罗卡品(170mg/kg，i.p.)。点燃的行为学表现以出现节律性点头、咀嚼、湿狗样抖动、继而直立、跌倒为判断标准。化学点燃后90min给予地西泮(10mg/kg，i.p.)终止发作，之后使用数字摄像机持续视频监测大鼠的行为学表现，并记录潜伏期、首次SRS发作的时间、慢性期SRS的发作频率及发作持续时间等。采用视频采集卡进行后期资料的采集和分析。对照组除了以生理盐水代替匹罗卡品外，其他处理与致痫组完全一致。
　　 应用免疫荧光标记NeuN来观察对照组和致痫后各组大鼠海马CA1区神经元的形态及数量，评估CA1区神经元的存活情况。免疫荧光染色结果的定量分析，采用连续冠状位冰冻切片(20μm)，每隔3张脑片取1张，每只大鼠选取5张脑片进行CA1区NeuN阳性细胞的计数，通过计算得出每只大鼠CA1区NeuN阳性细胞的均数及各组大鼠CA1区NeuN阳性细胞的均数±标准误。实验结果均用均数土标准误表示，先用单因素方差分析(one-way ANOVA)处理数据，然后用Tukey法(Tukey's post hoc tests)检测组间差异。
　　 结果：致痫组大鼠在注射匹罗卡品后24±3 min(n=51)被点燃，SE发作(statusepilepticus)均达4～5级。注射地西泮并不能立刻终止发作，但可以减轻发作强度、增加存活率。除7只大鼠死亡外，其余致痫组大鼠均存活。在注射地西泮5～7小时后，大鼠SE发作逐渐缓解。随后，致痫组大鼠进入发作后状态，持续约2～3天，期间大鼠仍有自限性的4～5级痫样发作(持续时间：10±3 min；平均发作频率：5±2次/天，n=38)，需要人工喂食，以流质为主。接下来，致痫大鼠经过一段长约9±1天(n=38)的潜伏期，在这段时期内大鼠无自发性痫样发作，可以自主摄食，但进食量及活动量与对照组相比明显减少，体重不增。首次自主发作(The first spontaneous recurrent seizure，SRS)出现在致痫后第12±1天(n=28)。有4只大鼠因未出现SRS或SRS发作形式无明显丛集性而从实验中删除。其余大鼠均有稳定的SRS发作(平均发作持续时间：4±2 min；平均发作频率：4±1次/天，n=28)。
　　 匹罗卡品致痫模型主要表现为DG门区及CA3区锥体细胞的凋亡，而CA1区的锥体细胞相对被保留。与对照组相比，致痫后各组大鼠海马CA1区NeuN阳性细胞计数无显著统计学差异。
　　 小结：
　　 1、致痫组大鼠的首次自主发作(SRS)出现在致痫后第12±1天(Mean±SEM，n=28)。
　　 2、慢性期和晚期组致痫大鼠均有稳定的SRS丛集性发作，平均发作持续时间4±2 min，平均发作频率4±1次/天(Mean±SEM，n=28>。
　　 3、与对照组相比，致痫后不同时期组大鼠海马CA1区NeuN阳性细胞计数无显著统计学差异，即致痫后CA1区的锥体细胞相对被保留。
　　 第二部分 C1C-2在大鼠海马的定位以及对照组和致病后各组海马CA1区C1C-2蛋白的定量分析
　　 目的：观察C1C-2在大鼠海马CA1区的定位；比较对照组和致痫后各组大鼠海马CA1区C1C-2的表达量。
　　 方法：应用免疫荧光双染技术对C1C-2进行组织学定位，单染技术比较对照组和致痫后各组C1C-2的表达情况。参考第一部分制做动物模型，分别取对照组、急性期组、潜伏期组、慢性期组和晚期组大鼠进行麻醉(乌拉坦1.5 g/Kg，i.p.)，经心脏灌注(肝素化生理盐水250ml，后接4％多聚甲醛400ml)。解剖动物，取出大鼠脑组织，4％多聚甲醛后固定，然后转入30％蔗糖溶液中。标本脱水后进行连续冰冻切片，脑片收集于0.01M PBS溶液中，切片厚度均为20μm，脑片用0.01M PBS溶液漂洗后，室温下用封闭液封闭1小时，以结合非特异性结合位点。弃去封闭液后加入一抗4℃过夜。吸去一抗后用0.01M PBS溶液漂洗三次，加入二抗避光室温孵育2小时，0.01M PBS溶液漂洗，避光贴片，置于荧光显微镜下观察并拍照。Western Blot检测对照组和致痫后各组大鼠海马CA1区C1C-2的表达量。取对照组和致痫后各组大鼠，快速断头取脑，将脑组织置于冰上，显微镜下分离出海马CA1区的组织，放入样品缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，冰上匀浆、超声破碎，取上清液分装保存于-80℃。酶联免疫吸附法测定上清液中C1C-2的含量。蛋白免疫印迹实验结果的半定量分析，应用生物凝胶图像分析系统扫描，Genegenius凝胶图像分析系统摄取图片并获得条带灰度值，GeneTool软件进行浓度的定量分析，以β-actin作为内参。先用单因素方差分析(one-way ANOVA)处理数据，再用Tukey法(Tukey's post hoc tests)比较对照组和致痫后各组的组间差异。
　　 结果：免疫荧光双染结果发现：C1C-2主要定位大鼠海马CA1区锥体细胞的胞体上，在锥体细胞的顶树突近端也有C1C-2相对较低的表达。C1C-2与星型胶质细胞、小胶质细胞之间没有共染。单染结果显示，致痫组大鼠海马CA1区的C1C-2IR增强，尤其是锥体细胞顶树突区的C1C-2 IR信号明显增强，而锥体细胞胞体上的C1C-2 IR无明显改变，这一现象在进入慢性期和晚期的癫痫大鼠脑片上尤为明显。
　　 Western Blot结果显示，致痫后急性期组大鼠CA1区的ClC-2蛋白表达量与对照组相比无显著差异，慢性期组和晚期组C1C-2蛋白表达量明显高于对照组。
　　 小结：
　　 1、对照组大鼠海马CA1区C1C-2与锥体细胞存在共染，在锥体细胞的胞体高表达，顶树突区近端也有相对较低水平的表达。
　　 2、致痫后，尤其是进入慢性期的大鼠，锥体细胞的顶树突区C1C-2 IR明显增强，而锥体细胞的胞体上C1C-2 IR无明显改变。
　　 3、与对照组相比，慢性期组和晚期组CA1区C1C-2的表达量明显上调。
　　 第三部分海马CA1区C1C-2功能性上调与α5亚基-GABAAR介导的紧张性抑制有关
　　 目的：研究慢性颞叶癫痫大鼠海马CA1区C1C-2表达上调是否具有功能；该区α5亚基-GABAAR介导的紧张性抑制有何改变；C1C-2与α5亚基-GABAAR介导的紧张性抑制是否有关。
　　 方法：选取对照组和慢性期组大鼠制作海马脑片，全细胞模式记录海马CA1区锥体细胞的C1C-2电流和α5亚基-GABAAR介导的紧张性抑制电流(Itonic)，比较对照组和慢性期组C1C-2电流和Itonic的变化；观察应用特异性α5亚基-GABAARs阻断剂(L-655，708)干预后C1C-2电流和Itonic的改变。将大鼠快速断头取脑，脑组织浸入4℃切片液中，振动切片机冠状位切片(400μm)，将脑片转置32℃的人工脑脊液中孵育1h后记录。切片液、人工脑脊液需事先通混合气(含95％氧气和5％二氧化碳)至少30min。记录槽内持续循环灌注细胞外液(5ml/min)。将脑片置于记录槽中，在红外相差显微镜下，全细胞模式记录CA1区锥体细胞的C1C-2电流(钳制电压：-10mV，测试电压：+40mV～120mV，跃级增量：-20mV)，消除液接电位、吉欧封接、破膜、补偿电极电容和膜电容，稳定5min后开始记录，滤波2Hz，采样20Hz。观察对照组和慢性期组大鼠海马CA1区锥体细胞的C1C-2电流的差别。外液中加入L-655，708(100nM)后，记录C1C-2电流的变化。全细胞模式记录Itonic，钳制电压-60mV，在细胞外液加入TTX(200nM)、Kynurenic acid(3mM)和CGP-52432(5μM)分别阻断动作电位、兴奋性谷氨酸受体电流和GABABR，同时补充外源性GABA(5μM)后，记录GABAAR介导的电流，基线记录平稳后，在细胞外液中加入适当浓度的L-655，708(100nM)选择性阻断介导紧张性抑制的α5亚基-GABAAR，电流平稳后再加入饱和浓度的SR-95531(100μM)完全阻断介导时相性和紧张性抑制的所有GABAAR。选取采样点：加药前100s(t1)、L-655，708加药后200s(t2)和SR-95531加药后100s(t3)，采集并计算出加药前后t1、t2、t3电流的平均增量，即△Ihold t3-t1和△Ihold t3-t2，△Ihold t3-t1代表GABAAR介导的总电流，△Ihold t3-t2代表GABAAR介导的时相性抑制电流的成分。通过计算(∣△Ihold t3-t1-△Ihold t3-t2∣)可以得到α5亚基-GABAAR介导的紧张性性抑制电流Itonic。每组大鼠的△Ihold t3-t1和△Ihold t3-t2均以均数±标准误来表示。比较单个神经元加药前后的差异用KS法(Kolmogorov-Smirnov test)；检测组间差异先用单因素方差分析(one-way ANOVA)处理数据，然后用Tukey法(Tukey'spost hoc tests)。
　　 手术置入侧脑室给药管(外径0.7mm、内径0.36mm的套管)，位置：前囟后0.5mm旁开1.2mm深4mm。用牙托粉固定套管，术后7天匹罗卡品致痫，致痫大鼠进入潜伏期开始侧脑室给予L-655，708，每天两次(9am～9pm)，每次侧脑室注射量为5μl，持续给药至SRS出现后14天。实验分为给药组和空白对照组。根据L-655，708浓度的不同，给药组又分为2μM、4μM、8μM和16μM组，观察该药对大鼠行为学的影响。记录给药各组首次SRS发作的时间、慢性期SRS发作频率和发作持续时间，与空白组进行比较。
　　 结果：癫痫慢性期组的C1C-2电流较对照组增大了53.2％(对照组：453.1±47.4 pA，n=9；癫痫组：694.5±56.2 pA，n=12；P<0.05)。外液中加入100 nM L-655，708后C1C-2电流减小了26.9％(空白组：702.3±63.1 pA，n=10；给药组：513.6±50.2pA，n=15；P<0.05)。癫痫组α5亚基-GABAAR介导的紧张性抑制电流(Itonic)明显大于对照组(对照组：132.1±17.9 pA，n=12；癫痫组：207.4±13.6 pA，n=15；P<0.05)。L-655，708可显著抑制癫痫组Itonic(-30.3±7.9％，n=11，P<0.05)，但对于对照组Itonic则无明显影响(-21.6±9.2％，n=7，P>0.05)。
　　 侧脑室给予致痫大鼠不同浓度的L-655，7088并观察大鼠行为学表现，8μM和16μM组大鼠首次SRS出现的时间早于空白组(给药组9±1天，n=7，空白组：12±1天，n=7；P<0.05)，但慢性期SRS发作频率和发作持续时间未见显著组间差异。
　　 小结：
　　 1、癫痫组ClC-2电流较对照组明显增大，说明在病理状态下海马CA1区C1C-2表达上调是有功能的。
　　 2、癫痫组海马CA1区α5亚基-GABAAR介导的紧张性抑制电流(Itonic)显著大于对照组；L-655，708可显著抑制癫痫组Itonic，但对于对照组Itonic则无明显抑制作用。说明对照大鼠脑组织中是以时相性抑制为主，紧张性抑制做为一种背景电流；而在癫痫大鼠脑组织中α5亚基-GABAAR介导的紧张性抑制电流明显增强，可能是对病理状态下时相性抑制减弱的一种代偿现象。
　　 3、离体脑片上应用L-655，708可翻转癫痫组增大的C1C-2电流。说明病理状态下，C1C-2功能性上调与α5亚基-GABAAR介导的Itonic代偿性增强有关。
　　 4、在体动物侧脑室注射L-655，708可使致痫大鼠首次SRS提早出现，但对慢性期SRS发作频率和发作持续时间无明显影响。说明Itonic增强可以延长SE发作后的潜伏期，延缓SRS的出现，即α5亚基-GABAAR介导的紧张性抑制与SRS的形成有关，与慢性期SRS反复发作无关。
　　 第四部分α5亚基-GABAAR介导的紧张性抑制对慢性颞叶癫痫大鼠海马突触可塑性的影响
　　 目的：研究癫痫组(慢性期)大鼠海马CA1区突触可塑性有何改变；应用α5亚基-GABAAR特异性阻断剂对慢性颞叶癫痫大鼠海马LTP/LTD的诱导有何影响。
　　 方法：本部分实验应用在体记录大鼠海马CA1区场电位的技术。以20％乌拉坦(7.5ml/kg i.p.)麻醉动物，将大鼠头部固定于脑立体定位仪上，以H2O2清除皮下组织和筋膜，充分暴露颅骨中缝和前囟。在颅骨上标记刺激电极(前囟后4.2mm，中线左侧旁开3.8mm，深3200～3500μm)、记录电极(前囟后3.4mm，中线左侧旁开2.5mm，深2200～2500μm)和侧脑室给药管(前囟后0.5 mm，中线右侧旁开1.0 mm，深4000μm)的位置，用电钻在标记点上钻孔，借助微电极操作仪将电极和给药管缓慢送入目标位置。用牙托粉将不锈钢给药管固定，自然晾干。连续单方波刺激海马Schaffer collateral pathway的同时，在CA1区辐射层记录Schaffer→CA1的兴奋性突触后场电位(field excitatory post-synapticpotentials，fEPSPs)。高频刺激(100 Hz，每串50个刺激，每串间隔15s，4串)诱导海马LTP；低频刺激(1 Hz，900个刺激，15min)诱导海马LTD。给予条件刺激之前，应用测试刺激至少稳定记录30min做为baseline；侧脑室给药后需继续记录至少30min再诱导LTP/LTD，以观察药物本身对电位是否有影响。给药时先用微量注射器缓慢推注5μ1(L-655，708或vehicle)，时间控制在2min左右，再用输液微泵维持至实验结束(推速：0.5μl/h)。该实验以海马CA1区fEPSPs的幅度作为提取参数，每10个连续的测试刺激做一次平均，以加药前或条件刺激前海马fEPSPs幅度的均值做为对照，所得数据由LTP、SPSS10.0软件进行统计分析，比较加药前、后的差异用Wilcoxon signed ranks检验，组间比较用Kruskal-Wallis test检验。
　　 Western Blot检测对照组和癫痫组(慢性期)大鼠海马CA1区NR1、NR2A、NR2B、GluR1、GluR2和GluR3的表达量。在体实验结束后，分别取对照组和癫痫组大鼠脑组织，显微镜下分离，放入样品缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，冰上匀浆、超声破碎，取上清液分装保存于-80℃。酶联免疫吸附法测定上清液中上述目的蛋白的含量。蛋白免疫印迹实验结果的半定量分析，应用生物凝胶图像分析系统扫描，Genegenius凝胶图像分析系统摄取图片并获得条带灰度值，GeneTool软件进行浓度的定量分析，以β-actin作为内参。先用单因素方差分析(one-way ANOVA)处理数据，然后用Tukey法(Tukey's post hoc tests)比较对照组和癫痫组的组间差异。
　　 结果：高频刺激(high-frequency stimulation，HFS)诱导癫痫组海马CA1区fEFSPs的幅度显著低于对照组(癫痫组：128.5±9.43％，n=5；对照组：150.9±7.57％，n=5，P<0.05)；低频刺激(low-frequency stimulation，LFS)诱导癫痫组海马CA1区fEFSPs幅度显著高于对照组(癫痫组：117.2±6.22％，n=5；对照组：68.3±7.31％，n=5，P<0.05)。L-655，708对高频刺激诱导海马LTP的fEFSPs幅度无明显影响(给药组：132.4±7.01％，n=5；空白组：130.3±7.36％，n=4，P>0.05)；L-655，708可部分抑制低频刺激诱导海马LTD的fEFSPs幅度(给药组：91.6±6.57％，n=5；空白组：113.7±6.91％，n=4，P<0.05)。
　　 应用Western Blot技术检测对照组和癫痫组大鼠海马CA1区NR1、NR2A、NR2B、GluR1、GluR2和GluR3的表达量。癫痫组NR1和NR2A的表达量明显高于对照组；而NR2B的表达量显著减低。癫痫组GluR2的表达量明显低于对照组，同时GluR1和GluR3显著增高，癫痫组GluR2/GluR1+GluR3比值显著低于对照组。
　　 小结：
　　 1、高频刺激诱导癫痫组海马CA1区LTP的fEFSPs幅度显著低于对照组；低频刺激诱导癫痫组海马CA1区fEFSPs幅度则明显高于对照组，并翻转形成LTP。说明癫痫组大鼠强化记忆的功能明显减退，同时纠错和删除记忆的功能也有所削弱。
　　 2、L-655，708对高频刺激诱导海马LIP的fEFSPs幅度无明显影响：可部分抑制低频刺激诱导海马LTD的fEFSPs幅度。说明L-655，708可以改善癫痫大鼠的纠错和删除记忆功能，避免LTP过饱和，从而维持相邻突触LTP的诱导阈值。
　　 结论
　　 正常大鼠中，C1C-2主要定位于海马CA1区锥体细胞的胞体上，在锥体细胞顶树突的近端也有相对较低水平的表达。致痫后，尤其是进入慢性期的大鼠，海马CA1区C1C-2的表达量明显上调，且具有功能性，以锥体细胞顶树突区的C1C-2上调显著。
　　 慢性颞叶癫痫大鼠海马CA1区α5亚基-GABAAR介导的紧张性抑制电流(Itonic)显著增大；在离体脑片上应用L-655，708可显著抑制Itonic并翻转增大的C1C-2电流。致痫后，持续侧脑室给予L-655，708可使癫痫大鼠首次SRS提早出现，但对慢性期SRS发作频率和发作持续时间无明显影响；在体应用L-655，708可改善癫痫大鼠海马CA1区LTD的诱导。