Fra-1与乳腺癌的发生及侵袭转移相关性的实验研究

摘要

Fra-1是转录因子AP-1家族中的一员，最近研究发现Fra-1过表达可促进细胞的运动、侵袭。在鼠成纤维细胞中过表达Fra-1可导致贴壁非依赖性生长以及恶性转化。在多种肿瘤如乳腺、肺、结肠以及转化的细胞系中检测到Fra-1 mRNA及蛋白水平的高表达。然而有关Fra-1在良、恶性乳腺组织中的表达、Fra-1是否增加肿瘤的侵袭和迁移，Fra-1调控哪些侵袭转移相关基因鲜有报道。 本研究通过免疫组织化学方法检测Fra-1在良、恶性乳腺肿瘤中的表达差别，发现良、恶性乳腺肿瘤的细胞核和细胞质都存在Fra-1表达，但Fra-1在恶性肿瘤细胞质中的表达明显高于良性肿瘤，提示与乳腺癌的发生相关。统计学分析结果表明Fra-1在恶性肿瘤细胞质中的表达与乳腺癌预后指标ER、PR和HER2的表达均无相关性。RT-PCR及Western Blot分析结果证实，高侵袭性的乳腺癌细胞中Fra-1 mRNA及蛋白的表达水平增高，低侵袭性的乳腺癌细胞中Fra-1 mRNA和蛋白则低表达或不表达。 随后，构建了Fra-1真核表达载体，在低侵袭性的MCF-7乳腺癌细胞中过表达Fra-1，通过集落形成实验、黏附实验、迁移实验观察Fra-1对乳腺癌细胞侵袭和迁移的影响。结果显示Fra-1可增加乳腺癌细胞的增殖、黏附和迁移能力，RT-PCR分析发现，Fra-1对AP-1部分家族成员有调控作用。 为进一步研究Fra-1参与肿瘤侵袭迁移的机制，我们构建了pGL3-MMP-9启动子报告载体，分析Fra-1对侵袭转移相关基因MMP-9启动子活性的影响。双荧光素报告载体分析实验发现，Fra-1对MMP-9的启动子活性无明显影响。重新对MMP-9启动子进行生物信息学分析，发现MMP-9启动子上AP-1反应元件(TRE)与转录因子Stat3的反应元件(SIE)相毗邻。再次应用双荧光素报告载体分析，发现Fra-1与Stat3协同参与了对MMP-9的启动子的调控，结果表明Fra-1协同Stat3明显增加了MMP-9的启动子活性。采用Fra-1、Stat3C共转染后明胶酶谱实验证实MMP-9的酶活性显著增高。通过免疫共沉淀实验证实Stat3与Fra-1/c-Jun存在相互作用；寡核苷酸pull down实验证实，Stat3、 Fra-1/c-Jun与含TRE和SIE的MMP-9启动子序列在体外存在直接的相互作用。染色质免疫共沉淀结合PCR(ChIP-PCR)方法进一步确证，Stat3和Fra-1与含TRE元件及SIE元件的MMP-9启动子序列的原位结合。 综上所述：(1)Fra-1在乳腺恶性肿瘤细胞质中的表达明显高于乳腺良性肿瘤，可能与乳腺癌的发生发展相关。(2)过表达Fra-1可增加乳腺癌细胞的增殖、黏附和迁移，提示Fra-1与乳腺癌的侵袭和迁移相关。(3)Fra-1协同Stat3调控侵袭转移相关基因MMP-9，Fra-1可能通过协同Stat3调控MMP-9，促进肿瘤细胞的侵袭和迁移。

目录

声明

摘要

前言

第一部分Fra-1在人乳腺肿瘤组织中的表达

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分Fra-1与乳腺癌侵袭转移的关系的实验研究

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第三部分Fra-1对侵袭转移相关基因MMP-9的调控

材料与方法

结果

讨论

参考文献

结论

全文创新点

附录

致谢