含编码鸡Ⅱ型胶原基因的新型DNA Tolerizing疫苗的研制及其在治疗大鼠类风湿关节炎中的疗效观察

摘要

本文将口服免疫耐受与基因治疗性疫苗两大策略充分进行有机结合以期创新性研制全新型DNA Tolerizing治疗性疫苗，通过RA动物模型系统评价该疫苗的体内治疗疗效，并探索该疫苗疗效的作用机制尤其是T细胞耐受机制。 根据真核表达载体pcDNA3.1上的酶切位点EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ以及CCOL2A1全长cDNA上的信号肽序列设计引物，同时还在引物上添加了Kozak序列和信号肽序列，PCR扩增测序正确后连接到pcDNA3.1上，即获得本实验所需要的基因疫苗pcDNA3.1-CCOL2A1。为了检证所构建的真核表达载体pcDNA3.1-CCOL2A1能否在体外有效地表达，将其转染到COS-7细胞(10<'8>)中。经G418筛选后，培养阳性克隆，收获、浓缩、真空干燥培养液，然后再溶解在0.1 mol/L的乙酸中。产物经15％SDS-PAGE电泳检测，在143kD左右处可见一电泳条带，经Western-Blot分析证明，在约143kD左右亦可见到特异性反应条带，与质粒pcDNA3.1-CCOL2A1基因表达的CCⅡ蛋白相对应。而仅转染pcDNA3.1空载体的细胞培养液中则没见特异性条带出现。由此证明pcDNA3.1-CCOL2A1能在COS-7细胞中有效表达CCⅡ多肽链的α亚单位，而且是分泌型表达。 胶原蛋白的表达是一个非常复杂的过程，涉及到翻译后加工、糖基化、羟基化等多种步骤，至少需要8种酶的参与，其中脯氨酸羟化酶P4Hα、β两个亚基的羟基化作用尤为重要，它能特异的使胶原三肽重复序列Gly-X-pro中的脯氨酸残基羟基化。而羟化脯氨酸对于在生理条件下形成稳定的胶原三螺旋结构是必需的，并且P4H的活性与胶原的合成呈平行关系，胶原表达量的提高有赖于P4H与其的共表达。为了验证我们所构建的基因疫苗pcDNA3.1-CCOL2A1所表达的CCⅡ是否是羟基化的氨基酸，采用MALDI-TOF-MS进行了相关分析。将SDS-PAGE中特异性条带切割下来，经过胶内酶切后进行肽质量指纹谱的鉴定，然后选取肽段进行ESI-MS/MS分析。串联质谱图经Micromass专用软件MaxEnt3处理后，用Spectrum通过Mascot查询NCBI、SWISSPROT等数据库进行比对，结果证明该产物的确为alpha 1 type Ⅱ procollagen[Gallus gallus]，即鸡Ⅱ型胶原蛋白α链；其中脯氨酸(Pro)未被修饰，m/z为416.19。由此提示，基因疫苗pcDNA3.1-CCOL2A1所表达的CCⅡ至少有部分没有被羟基化，因为所挑选的肽段中的脯氨酸并没有被羟基化。那么，这种缺乏脯氨酸羟化酶P4Hα、β的pcDNA-CCOL2A1基因疫苗所表达的产物是否具有生物学功能?尤其是在RA大鼠体内能否诱导有效的免疫耐受?则是我们最为关注的大问题。因此，采用天然CCⅡ在Wistar大鼠中建立了标准的CIA大鼠RA模型。CIA的发病率高达73％(45/62)。经四肢关节肿胀程度评分、放射影象学和组织病理学验证，该模型与文献报道的一致，完全符合CIA大鼠RA模型体内实验治疗的标准要求。体内实验结果表明，空载体组和20μg/kg基因疫苗治疗组对CIA大鼠四肢关节肿胀程度无任何治疗作用；200μg/kg基因疫苗治疗组可明显减轻四肢关节肿胀程度，与其他所有组比较差异有统计学意义(*P<0.05)，尤其是与目前临床上用于治疗RA病人的“金标准”治疗MTX组的疗效几近相同；而400μg/kg高剂量基因疫苗组却可使关节炎指数略有升高。随后的组织病理学检查及其评分结果显示，注射200μg/kg pcDNA3.1对照组其后足有明显的血管翳形成，滑膜增生和大量淋巴细胞浸润，关节软骨变薄且失去完整性，几乎观察不到完整的骨小梁，骨髓腔部为分布有大量破骨细胞；20μg/kg及400μg/kg治疗组与关节炎对照组的结果相类似；而200μg/kg治疗组和MTX治疗组关节软骨及其下的骨小梁结构与正常组接近，但关节滑膜亦有一定程度的增生。由此表明在所选择的20μg/kg、200μg/kg、400μg/kg 3种基因疫苗治疗剂量中，200μg/kg剂量组对CIA大鼠后足踝关节的炎症以及软骨和骨的破坏的抑制作用最为明显，可使炎症分数下降为对照组的50％(*P<0.05)。对CIA大鼠后足踝关节X光放射学表现及评分结果进一步分析表明：在关节炎对照组可见软组织肿胀，骨关节边缘模糊，软骨破坏；而在所选择的三种治疗剂量组中，只有200μg/kg治疗组治疗效果最明显(*P<0.05)，可使软组织肿胀减轻，关节间隙清晰，MTX治疗组效果与200μg/kg治疗组治疗效果接近；而20μg/kg和400μg/kg治疗组的关节软骨表面和骨密度与关节炎组比较变化不明显；此外，20μg/kg治疗组的放射学分数与空载体组类似，而400μg/kg治疗组的放射学分数却稍有升高。特别应该指出的是，200μg/kg基因疫苗组象MTX治疗组一样能显著降低CIA大鼠血清中的抗CⅡ抗体水平(P<0.05)，而20μg/kg基因疫苗组与空载体组相比变化不大(P>0.05)，但400μg/kg基因疫苗组却显著升高(P<0.05)。因为业已证实，抗CⅡ抗体水平反映了RA早期阶段炎症和骨质破坏的程度，被认为是揭示关节炎严重程度最可靠的指标。由此证明了pcDNA3.1-CCOL2A1基因疫苗对CIA大鼠关节炎有显著的治疗作用，在缺乏外源脯氨酸羟化酶P4Hα、β的情况下并未影响pcDNA3.1-CCOL2A1基因疫苗的体内治疗效应。为了探索pcDNA3.1-CCOL2A1基因疫苗有效治疗CIA大鼠的相关机制，较为系统的观察了CIA大鼠注射pcDNA3.1-CCOL2A1基因疫苗后4周脾细胞培养液中Th1和Th2因子如FGF-β1、TNF-α、IL-10、IL-4浓度的变化，CIA大鼠脾淋巴细胞特异性和非特异性增殖能力，CIA大鼠外周血中Th1/Th2细胞比例，CIA大鼠外周血中CD4<'+>CD25<'+>Treg细胞占PBMC的比例以及大鼠外周血DC占PBMC的比例等指标。结果表明：200μg/kg基因疫苗组的TGF-β和IL-10水平明显增高(P<0.05)，TNF-α浓度显著降低(P<0.05)，而IL-4的浓度水平各组之间无明显变化(P>0.05)；20αg/kg和1400αg/kg基因疫苗组以及空载体组间则无显著变化(P>0.05)。脾淋巴细胞增殖试验结果显示：200αg/kg基因疫苗组和MTX治疗组的特异性脾淋巴细胞增殖能力明显下降，与空载体组比较具有统计学意义(P<0.05)，400μg/kg基因疫苗组的脾淋巴细胞增殖能力较空载体组却有升高现象，其余3组差别不明显(P>0.05)；当加入PHA进行非特异性刺激后，各治疗组的淋巴细胞都发生非特异性增殖，各组之间差别无统计学意义(P>0.05)。在检测CIA大鼠外周血中Th1/Th2比例时发现，Th1:Th2的比率在正常组平均为0.06(范围是0.03-0.09)，200 μg/kg治疗组为0.08(范围是0.06-0.11)，MTX治疗组为0.08(范围是0.05-0.16)，它们都显著比空载体对照组低(P<0.05)，表明了一个显著的Th1→Th2细胞的“shift”；而此比率在20 μg/kg与400 μg/kg治疗组以及空载体对照组之间没有明显区别(P>0.05)。鉴于CD4<'+>CD25<'+>Treg在参与免疫调控尤其是自身免疫反应的重要作用，比较了正常组与各治疗组以及空载体对照组中CD4<'+>淋巴细胞中CD4<'+>CD25<'+>Treg细胞所占的比例。结果发现：200μg/kg pcDNA3.1-CCOL2A1和MTX治疗组中CD4<'+>CD25<'+>Treg细胞比例明显高于对照组(P<0.05)；20μg/kg pcDNA3.1-CCOL2A1治疗组中的CD4<'+>CD25<'+>Treg细胞比例和对照组比几乎没有变化；而400μg/kg pcDNA3.1-CCOL2A1治疗组CD4<'+>CD25<'+>Treg细胞比例虽然比对照组高，但没有统计学意义。除此之外，又观察了基因疫苗治疗后CIA大鼠外周血DC占PBMC的比例，结果显示，正常组中OX-62阳性细胞(DC)占外周血单个核细胞的比例为0.93±0.35％，CIA大鼠经pcDNA3.1-CCOL2A1基因疫苗治疗4周后而各个治疗组中的OX-62阳性细胞占外周血单个核细胞的比例分别为1.48±0.70％，1.02±0.61％，1.18±0.31％，1.07±0.25％and 1.04±0.33％，200μg/kg pcDNA3.1-CCOL2A1治疗组与其它治疗组、正常组及对照组之间的差异有统计学意义，其余各个治疗组与正常组及对照组之间的差异都没有统计学意义(P>0.05)。尽管目前我们还没完全清晰pcDNA3.1-CCOL2A1基因疫苗有效治疗CIA大鼠的确切机制，但我们的上述结果高度提示，pcDNA3.1-CCOL2A1基因疫苗可能通过增加机体内CD4<'+>CD25<'+>Treg，以降低T细胞对CⅡ的特异性增殖反应，由此诱导了Th1→Th2细胞的“shift”，从而有效下调Th1-因子并上调了Th2因子。

目录

论文说明：缩写词表

声明

摘要

前言

第一章 pcDNA3.1-CCOL2A1基因Tolerizing疫苗的构建与鉴定

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

第二章 pcDNA-CCOL2A1基因Tolerizing疫苗治疗CIA模型疗效观察

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

第三章 pcDNA3.1-CCOL2A1基因Tolerizing疫苗治疗CIA大鼠的机理研究

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

结论

致谢

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专利

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