心脏微血管内皮细胞在病毒性心脏病心肌纤维化中的作用及其机制

摘要

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是心肌局限性或弥漫性的急性或慢性炎性病变。绝大多数患者预后良好;约10～15％的患者由于急性期后炎症持续、病情迁延反复，进展为扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy, DCM)。在原发性扩张型心肌病中，高达60％的患者能检测到病毒的感染。表明病毒感染是心肌炎心肌病重要的触发因素之一。
　　心肌纤维化贯穿于VMC和DCM的各个阶段，纤维化程度的高低与疾病的预后和对药物的反应密切相关。心肌成纤维细胞活化是心肌纤维化最主要的始动因素。既往研究认为器官中的成纤维细胞绝大多数依靠组织中存在的固有成纤维细胞增生、活化;近年来不断有研究证实，内皮细胞在某些病理状态下，也能够借由内皮间质转化(endothelial to mesenchymal transition，Endo-MT)转化为分泌细胞外基质的肌成纤维细胞，促进纤维化的发展。Endo-MT指的是在病理状态下，内皮细胞在细胞因子的作用下向间质细胞转化，其表型和功能均发生明显改变;即内皮细胞特异性的蛋白如血管钙粘蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-cadherin)和血管内皮粘附分子1/CD31(platelet-endothelial cell adhesionmolecular-1/CD31)表达减弱甚至消失;而间质细胞特异性的标志物如α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和成纤维细胞特异性蛋白1（fibroblast-specific protein-1，FSP1）表达增多，脱离微血管腔面、迁移进入组织，并获得分泌胶原蛋白的能力。
　　多种病毒可引起心肌炎，尤以肠道病毒中的柯萨奇病毒B3(CoxsackievirusB3，CVB3)最为常见。CVB3主要经呼吸道及消化道传播疾病，其感染具有特殊性，需要两次穿越内皮细胞至靶器官。病毒通过消化道及呼吸道粘膜内皮细胞进入外周血;之后病毒随血流进入冠脉微血管，穿越心脏微血管内皮细胞、感染心肌细胞。因而心脏微血管内皮细胞对于病毒的嗜心性具有重要的选择及保护作用;心脏微血管内皮细胞是排列在心脏冠脉微血管内的单层细胞层，是心肌细胞最重要和最后的一层保护屏障。在病理状态下，心脏微血管内皮还能分泌众多细胞因子，维持心脏微环境的平衡稳定。
　　既往我们关于病毒性心脏病的研究主要集中于病毒感染心肌细胞后引起的病理生理变化，忽略了心脏微血管内皮细胞在病毒感染所致的心脏损伤中的作用。作为心肌细胞最后和最重要的一层保护屏障，本研究在临床DCM患者中发现Endo-MT对心肌纤维化的潜在作用的基础上，鉴于病毒感染是心脏扩大重要的触发因素，我们围绕着CVB3感染如何通过损伤心脏微血管内皮细胞，从而促进了心肌损伤及心肌纤维化，以及病毒感染引起的内皮间质转化在心肌炎心肌纤维化中的作用及可能的分子机制展开研究。
　　第一部分:内皮间质转化在扩张型心肌病心肌重构中的作用
　　[目的]：扩张型心肌病以左室增大和心肌纤维化为特点。有报道表明内皮间质转化(endothelial-to-mesenchymal transition，Endo-MT)参与动物模型中器官纤维化的形成。本研究致力于阐明Endo-MT是否参与了DCM心肌纤维化的进程。
　　[方法]：在40名DCM心脏移植患者的废弃心肌组织和正常对照组心肌组织中采用免疫组化检测内皮细胞标志物(CD31 and VE-cadherin)和成纤维细胞标志物(α-SMA and FSP1)，并将此与患者的临床资料特点进行分析。使用共聚焦检测内皮细胞和成纤维细胞标志物共定位情况。免疫印迹法检测Wnt、β-catenin和snail的蛋白水平。
　　[结果]：与正常对照心肌相比，患者病变心肌内皮细胞标志物(CD31，P＜0.01;VE-cadherin, P＜0.01)明显减少，而成纤维细胞标志物(α-SMA，P＜0.01;VE-cadherin，P＜0.01)上升明显。内皮细胞标志物与患者左室舒张末期内径呈现明显的负相关(CD31，r=-0.82，P＜0.01;VE-cadherin，r=-0.73，P＜0.01);而成纤维细胞标志物呈现中度正相关(α-SMA，r=0.65，P＜0.01;FSP1，r=0.53，P＜0.01)。免疫印迹显示经典Wnt信号通路和snail蛋白水平均在病变心肌组织中升高明显(P＜0.01)。
　　[结论]：本研究在患者DCM样本中发现Endo-MT有可能为DCM心肌纤维化的潜在机制之一，其与DCM心室重塑具有相关性。Endo-MT的发现及其可能的对抗因子的出现为DCM治疗提供了一个新的靶点。
　　第二部分柯萨奇病毒感染致心脏微血管内皮细胞功能损害及对心肌炎心肌纤维化的影响
　　[目的]：柯萨奇病毒(Coxsackievirus B3，CVB3)感染是病毒性心肌炎最常见的病原。CVB3病毒感染具有特殊性，需要两次穿越血管内皮至靶细胞;心脏微血管内皮细胞正是病毒感染最重要和最后一层屏障，对病毒的嗜心性具有重要的选择和保护作用。目前对CVB3病毒感染心脏微血管内皮细胞研究较少。本研究探讨CVB3病毒对心脏微血管内皮细胞的易感性及随之而来的生物学改变，并观察其在病毒性心肌炎心肌纤维化中可能的作用。体外微血管内皮细胞通透性实验和电镜证据均表明感染病毒后微血管内皮细胞的屏障功能受到破坏。
　　[方法和结果]：qPCR法检测感染病毒后CMVECs中病毒RNA的变化，发现从day0-day7，细胞内CVB3的RNA持续性表达升高，这种病毒复制在48-72小时内达到高峰(P＜0.01);TCID法检测上清中的病毒滴度，显示从感染开始至感染后第7天，上清中的病毒滴度始终波动于10-4～10-6;说明CMVECs是CVB3病毒的易感细胞，病毒RNA在CMVECs中能持续性复制，CMVECs在感染病毒后具有持续性释放病毒的能力。采用流式检测caspase3的活性，显示病毒感染后第7天caspase3活性明显上升(P＜0.01);病毒感染后Bax/Bcl-2的比值随着感染时间的延长而逐渐增高，表明CVB3病毒能够导致CMVECs增殖减低、凋亡增加。免疫印迹显示感染病毒后CMVECs持续性上升表达TGF-β1;使心脏微血管内皮细胞发生Endo-MT转变为活化的成纤维细胞，并诱导邻近的心肌细胞分泌细胞因子，导致正常心肌结构的破坏和异常细胞外间质沉积，从而促进心肌炎后心室重塑。
　　[结论]：本部分研究表明心脏微血管内皮细胞也是CVB3病毒重要的宿主细胞之一;并能够诱导众多的生物学改变，有可能在急慢性病毒性心肌炎的心肌损伤和心肌纤维化中发挥了重要的作用。
　　第三部分:内皮间质转化在病毒性心肌炎心肌纤维化中的作用及其调控因子
　　[目的]：心肌纤维化贯穿于病毒性心肌炎各个阶段，其程度与心肌炎的病程与预后密切相关。心脏成纤维细胞是心肌组织中分泌细胞外基质的主要细胞，既往认为其主要来源于心脏固有成纤维细胞。近年来报道内皮细胞在损伤刺激下可以通过Endo-MT转化为活化的成纤维细胞，参与心肌重塑。本部分就病毒感染引起的内皮间质转化在心肌炎心肌纤维化中的作用展开研究，并寻找可能的调控因子。
　　[方法]：建立小鼠病毒性心肌炎模型。采用小鼠超声心动图检测心功能;HE和天狼猩红染色观察心肌炎症和胶原沉积;共聚焦检测小鼠心肌中内皮细胞和成纤维细胞标志物的共定位情况;免疫印迹和细胞双免疫荧光半定量心脏微血管内皮细胞和成纤维细胞标志物的表达;qPCR法定量细胞中转录因子的RNA含量。
　　[结果]：病毒感染14天后，小鼠超声心动图检测发现心肌炎组小鼠心室腔增大、心室EF值降低。HE和SR染色显示心肌炎组小鼠心肌炎症细胞浸润、出现灶性坏死，肌纤维排列不规则、胶原沉积。共聚焦显示心肌炎小鼠心肌中存在内皮细胞和成纤维细胞标志物共定位，即存在Endo-MT;而这种共定位在对照组小鼠中缺失。将SB431542加入培养的心脏微血管内皮细胞，发现SB431542能够减弱病毒感染引起的Endo-MT，并能使转录因子Snail、Slug基因表达下降;SB4315421是TGF-β1特异性抑制剂，表明感染病毒后心脏微血管内皮细胞发生的Endo-MT是由其自身分泌的TGF-β1介导。
　　[结论]：本研究在病毒性心肌炎模型小鼠中验证了Endo-MT是心肌炎后心肌纤维化的重要始动因素，并推测出TGF-β1是该过程的重要调控因子。
　　第四部分:BMP7对病毒性心肌炎小鼠心肌纤维化的影响及其机制
　　[目的]：心肌纤维化是病毒性心肌炎的特征，与病程和预后密切相关;逆转纤维化进程，有助于疾病的恢复。BMP7是TGF-β家族中的一员，认为有抵抗TGF-β1的作用。本研究通过外源性的予以BMP7干预，观察其对病毒性心肌炎小鼠心功能及心肌纤维化的影响，并探讨其可能的机制。
　　[方法]：qPCR法观察病毒性心肌炎病程中BMP7和TGF-β1的表达量的变化;小动物超声心动图、HE和SR染色观察BMP7干预后小鼠心功能的恢复、小鼠心肌炎症浸润及胶原沉积情况。共聚焦检测观察BMP7干预后End-MT变化情况。免疫印迹分析可能的信号通路分子TGF-β1、p-smad3、smad3、smad4、Wnt和β-catenin的蛋白含量。
　　[结果]：qPCR法发现病毒性心肌炎心肌组织中BMP/TGF-β1比值持续性下降。BMP7干预后，能提高小鼠生存率，心肌组织炎症浸润和纤维化程度降低。BMP7能显著降低心肌炎小鼠的Endo-MT、内皮细胞与成纤维细胞标志物共定位现象明显降低。免疫印迹结果，BMP7能使心肌炎心肌组织中升高的TGF-β1、p-smad3、smad3、smad4和Wnt、β-catenin蛋白水平。
　　[结论]：本研究阐明了BMP7能够延缓病毒性心肌炎心肌纤维化的进程，其作用主要通过TGF-β1/smad和经典Wnt/β-catenin两条信号通路抑制病毒感染的心脏微血管内皮细胞发生的内皮间质转化，从而延缓纤维化、改善心脏功能。

目录

英文缩略语

摘要

前言

第一部分：内皮间质转化在扩张型心肌病心肌重构中的作用

引言

材料和方法

结果

讨论

第二部分 柯萨奇病毒感染致心脏微血管内皮细胞功能损害及对心肌炎心肌纤维化的影响

引言

材料和方法

结果

讨论

第三部分 内皮间质转化在病毒性心肌炎心肌纤维化中的作用及其调控因子

前言

材料和方法

结果

讨论

第四部分 BMP7对病毒性心肌炎小鼠心肌纤维化的影响及其机制

前言

材料与方法

结果

讨论

全文小结

参考文献

内皮间质转化—心肌纤维化新的调控机制

获得的资助

发表的论文

参加的学术会议

致谢

声明