卵泡刺激素多肽修饰的纳米给药系统靶向治疗卵巢癌淋巴转移的研究

摘要

卵巢癌死亡率高居妇女癌症死亡率的前五位。卵巢癌与其他实体肿瘤一样，在发生血行转移前，肿瘤细胞已经通过肿瘤周围的淋巴管播散，腹膜后淋巴结阳性率为54.3％。淋巴结转移是卵巢癌重要的预后因素并直接关系到治疗方案的选择。不同分期及分级的卵巢癌淋巴结阳性率不同，Ⅰ期卵巢癌发生淋巴结转移的占4.2％，Ⅱ期卵巢癌为35.7％，Ⅲ期卵巢癌为41.3％，而Ⅳ期卵巢癌则高达87.5％。病理分级为G1级的卵巢癌发生淋巴结转移的占4.4％，G2级的为21.6％，G3级的为49.1％。然而，淋巴转移的具体机制尚不明确，到目前为止还没有有效的针对卵巢癌淋巴转移的治疗方法。
　　瘤体减灭术联合化疗是卵巢癌的常规治疗方案。对于已经发生淋巴转移的卵巢癌而言，手术常不彻底，传统化疗又缺乏特异性，因此疗效受到限制，而药物毒性作用较大。有研究显示化疗后仍有25％-77％的患者存在淋巴结转移，二探术中可发现17％-40％的患者有淋巴结转移。
　　靶向治疗能克服传统化疗药的这一不足。靶向给药系统可分为主动靶向和被动靶向两种。被动靶向仍存在特异性不足的缺陷，一种解决方法就是用靶细胞表面受体的特异性配体来修饰药物递送系统，以发挥配体-受体介导的特异性识别的主动靶向作用。
　　本课题组前期的研究显示，载紫杉醇的纳米粒对淋巴系统存在被动靶向作用，淋巴结中的药物浓度明显高于其他脏器。我们的另一项研究构建了卵泡刺激素多肽修饰的纳米给药系统(Follicle stimulating hormone peptide modifiednanoparticulate system，FSHP-NP)，并证实其能通过卵泡刺激素受体(Folliclestimulating hormone receptor，FSHR)介导的配体-受体特异性结合作用，对卵巢癌病灶实现主动靶向作用，而不增加药物毒性作用。因此理论上，卵泡刺激素多肽修饰的纳米给药系统应具有能在卵巢癌转移淋巴结中富集的能力，本研究的目的即为评价该系统对卵巢癌转移淋巴结的靶向作用以及将其用于治疗淋巴转移卵巢癌的疗效和对正常脏器的毒性作用。
　　本文第一部分用PCR和免疫细胞化学的方法来检测FSHR在Fischer344大鼠源性上皮性卵巢癌细胞株NuTu-19中的表达情况。结果表明NuTu-19细胞中FSHR的表达呈阳性，因此用促卵泡刺激素多肽(Follicle stimulating hormonepeptide，FSHP)修饰纳米给药系统，借助配体-受体介导的特异性内吞作用，来增加靶细胞中的药物浓度具有可行性。
　　第二部分中，以马来酰亚胺-聚乙二醇-聚乳酸(Maleimide-PEG-PLA)和甲氧基聚乙二醇-聚乳酸（Methoxyl PEG-polylactic acid，MPEG-PLA）为原料，用乳液/溶剂蒸发法开环聚合制得纳米粒(Nanoparticle，NP)。并用FSHβ81-95多肽片段修饰该纳米粒，制得FSHP-NP。并分别包载亲脂性的荧光探针6-香豆素(6-coumarin)和卵巢癌一线化疗药紫杉醇(PTX)，并测定了上述纳米粒的粒径、Zeta电位、药物包封率(Entrapping efficiency，EE)和载药量(Drug loadingcapacity，DLC)。
　　为了在免疫功能正常的大鼠体内建立淋巴转移的卵巢癌模型，在第三部分中我们分别在雌性Fischer344大鼠腹腔内和足垫内注射1×107的NuTu-19细胞建模，并评估两种模型中肿瘤细胞转移至淋巴结的能力。足垫移植瘤组，肿瘤细胞接种侧腘窝淋巴结转移率为100％。而腹腔移植瘤组则无淋巴结转移病灶。足垫移植瘤组的生存时间（18.429±1.112周）明显长于腹腔移植瘤组（10.286±0.505周）。所以这种将NuTu-19细胞接种到F344大鼠足垫内的方法能成功构建简单、高效、可重复性高的卵巢癌淋巴转移模型，因此我们在后面的研究中均使用这种建模方式。
　　第四部分的目的是评价FSHP-NP对淋巴转移的卵巢癌的靶向性作用。我们首先用荧光显微镜定性观察及流式细胞仪定量检测载6-香豆素的FSHP-NP在体外被卵巢癌细胞摄取的情况。结果表明，表达FSHR的NuTu-19细胞摄取FSHP-NP能力，明显强于不表达FSHR的SKOV-3细胞，且其摄取FSHP-NP的能力明显强于其摄取NP的能力，并存在时间浓度依赖性，差异具有统计学意义。而对于不表达FSHR的SKOV-3细胞而言，其摄取FSHP-NP和NP能力的差异不显著。然后我们进行药物分布实验确定不同的紫杉醇剂型在大鼠不同脏器中的分布情况，血浆分布显示市售紫杉醇(PTX)从尾静脉给药后迅速从血浆中清除，而纳米粒包载的紫杉醇（NP-PTX和FSHP-NP-PTX），血药浓度明显增加，且在血浆中的清除时间延长。在转移淋巴结中，PTX组的药物浓度最低，NP-PTX组药物浓度较高，而FSHP-NP-PTX组药物浓度最高。
　　第五部分的目的是评价载紫杉醇的FSHP-NP对淋巴转移的卵巢癌的疗效和药物毒性作用。在体外实验中，我们用SRB法评价不同紫杉醇制剂对NuTu-19细胞生长的抑制作用，结果显示在药物浓度为0.1μM和1μM时，FSHP-NP-PTX对卵巢癌细胞增殖的抑制率明显高于PTX及NP-PTX，在药物作用后的24h、48h及72h，FSHP-NP-PTX对卵巢癌细胞增殖的抑制率明显高于PTX，在药物作用后的48h，FSHP-NP-PTX对卵巢癌细胞增殖的抑制率明显高于NP-PTX，差异具有统计学意义。由此可见，抑制细胞增殖的能力为:FSHP-NP-PTX＞NP-PTX＞PTX。在体内实验中，我们在第三部分构建的足垫移植瘤模型中评价FSHP-NP-PTX的抗肿瘤疗效。每周1次连续7次大鼠尾静脉注射不同剂型的紫杉醇(PTX剂量为4.5mg/kg)，以生理盐水作为对照。在用药结束后1周，测定大鼠腘窝淋巴结的体积及重量为: FSHP-NP-PTX＜NP-PTX＜PTX＜NS。FSHP-NP-PTX组的中位生存时间（25.00±1.23周）明显长于NS组（18.71±1.05周）(P＜0.01)，PTX组（20.86±0.70周）(P＜0.01)以及NP-PTX组（22.71±0.78周）(P＜0.05)。另外，我们每周记录大鼠体重并在实验终止时测定大鼠的血常规及肝肾功能以及进行正常脏器的病理组织学检查以评估FSHP-NP-PTX的毒性作用。实验结果显示，各组间大鼠体重和血常规、肝肾功能指标没有显著性差异，正常脏器的病理组织学检查未见异常，说明用卵泡刺激素多肽修饰的纳米给药系统包载紫杉醇后并不增加紫杉醇的药物副作用。
　　综上所述， FSHP-NP能促使表达FSHR的细胞摄取其所包载的药物，从而增强药物抑制细胞增殖的能力，同时在荷瘤大鼠体内能增加转移淋巴结中的药物浓度，增加化疗药物的抗肿瘤疗效，而不增加其副作用。因此，卵泡刺激素多肽修饰的纳米给药系统有望成为针对发生淋巴转移的卵巢癌的一种高选择性的化疗药物载体。

目录

摘要

前言

第一部分 卵泡刺激素受体在大鼠卵巢癌细胞株中的表达

1 仪器和材料

1．1 仪器

1．2 材料

2 实验方法

2．1 细胞培养

2．2 半定量RT-PCR方法检测NuTu-19细胞中FSHR mRNA的表达

2．3 免疫细胞化学检测NuTu-19细胞中FSHR蛋白的表达

3 实验结果

3．1 FSHR mRNA在大鼠卵巢癌NuTu-19细胞中的表达

3．2 FSHR蛋白在大鼠卵巢癌NuTu-19细胞中的表达

4 讨论

4．1 FSH和FSHR

4．2 FSHR的结构

4．3 FSHR在卵巢癌中的表达

5 小结

第二部分 卵泡刺激素多肽修饰的纳米粒的制备和表征

1 仪器和材料

1．1 仪器

1．2 材料

2 实验方法

2．1 FSH结合片段的合成

2．2 卵泡刺激素多肽修饰的纳米粒的制备和表征

2．3 载6-香豆素的纳米粒的制备、表征和浓度测定

2．4 载紫杉醇纳米粒的制备、表征和浓度测定

2．5 统计学方法

3 实验结果

3．1 FSH结合片段的分子量与纯度检测

3．2 纳米粒的表征

3．3 载6-香豆素的纳米粒表征

3．4 6-香豆素体外HPLC分析方法的结果

3．5 载6-香豆素的纳米粒的载药量与包封率

3．6 载紫杉醇的纳米粒表征

3．7 紫杉醇体外HPLC分析方法的结果

3．8 载紫杉醇的纳米粒的载药量与包封率

4 讨论

4．1 纳米给药系统主体——纳米粒制备材料的选择

4．2 纳米给药系统靶向头基——多肽片段的选择

4．3 纳米给药系统所载模型药物的选择

5 小结

第三部分 大鼠卵巢癌淋巴转移模型的构建

1 仪器和材料

1．1 仪器

1．2 材料

2 实验方法

2．1 建立卵巢癌淋巴转移模型

2．2 病理组织学检查

2．3 生存分析

2．4 统计学方法

3 实验结果

3．1 F344大鼠腹腔移植瘤模型

3．2 F344大鼠足垫移植瘤模型

3．3 生存分析

4 讨论

4．1 卵巢癌细胞系和卵巢癌淋巴转移模型动物的选择

4．2 建模方式的选择

5 小结

第四部分 卵泡刺激素多肽修饰的纳米粒对卵巢癌淋巴转移的靶向性研究

第一节 卵泡刺激素多肽修饰的纳米粒对卵巢癌细胞的体外靶向性研究

1 仪器和材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 小结

第二节 卵泡刺激素多肽修饰的纳米粒对卵巢癌转移淋巴结的体内靶向性研究

1 仪器和材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 小结

第五部分 载紫杉醇的卵泡刺激素多肽修饰的纳米粒对卵巢癌淋巴转移的药效学研究

1 仪器和材料

1．1 仪器

1．2 材料

2 实验方法

2．1 载紫杉醇的卵泡刺激素多肽修饰的纳米粒抑制卵巢癌细胞增殖的体外研究

2．2 载紫杉醇的卵泡刺激素多肽修饰的纳米粒对卵巢癌淋巴转移的体内疗效研究

2．3 载紫杉醇的卵泡刺激素多肽修饰的纳米粒安全性的初步评价

2．4 统计学方法

3 实验结果

3．1 载紫杉醇的卵泡刺激素多肽修饰的纳米粒的体外药效学评价

3．2 载紫杉醇的卵泡刺激素多肽修饰的纳米粒的体内药效学评价

3．3 载紫杉醇的卵泡刺激素多肽修饰的纳米粒安全性的初步评价

4 讨论

4．1 药效学体外评价方法的选择

4．2 药效学体内评价方法的选择

4．3 药效学和药物靶向性研究结果的关联性

5 小结

总结

主要创新点

后继工作及展望

参考文献

综述 肿瘤淋巴转移靶向治疗的相关研究

中英文缩写对照

作者简介

致谢

声明