爪哇猴由环境内分泌干扰物引致性早熟疾病模型的建立及中药作用机制的研究

摘要

目的:(1)建立灵长类—爪哇猴由环境内分泌干扰物(environmental endocrinedisruptors，EEDs)引致的性早熟疾病模型。(2)在爪哇猴性早熟模型上验证滋阴泻火中药对EEDs拟雌激素活性的拮抗作用，以更准确地模拟人类的疾病过程及药物的治疗作用。(3)采用分子生物学实验方法，研究并阐明中药拮抗EEDs拟雌激素活性的作用机制，为开发具有自主知识产权的有效拮抗EEDs生殖毒性的中药制剂提供更为恰当的理论依据。
　　方法:(1)预实验:以青春前期雌性爪哇猴为实验对象，选取具有代表性的EEDs—壬基酚(4-nonylphenol，4-NP)及双酚A(bisphenol A，BPA)作为染毒物质，复制爪哇猴性早熟的疾病模型。爪哇猴分为两个月龄组，每个年龄组分高剂量染毒组、低剂量染毒组及对照组。每日空腹给药。以阴道脱落细胞成熟指数、子宫容积、子宫湿重、脏器系数、子宫内膜厚度、子宫肌层厚度、子宫内膜上皮细胞高度、子宫腺上皮高度为指标。结果采用单因素方差分析，观察EEDs的拟雌激素作用。确定爪哇猴性早熟疾病模型建立的最佳月龄、最佳染毒剂量及最佳染毒时间。(2)以最佳月龄的青春前期雌性爪哇猴为实验对象，以最佳剂量的壬基酚(nonylphenol，4-NP)及双酚A(bisphenol A，BPA)复制联合染毒的性早熟疾病模型。爪哇猴随机分为染毒组，治疗组及对照组，每日空腹给药。染毒组喂饲4-NP及BPA，治疗组喂饲4-NP、BPA及中药，对照组喂饲溶剂玉米油。以雌激素水平、阴道脱落细胞成熟指数、子宫湿重、脏器系数、子宫内膜厚度、子宫肌层厚度、子宫内膜上皮细胞高度、子宫腺上皮高度为指标，结果采用单因素方差分析，验证中药对EEDs拟雌激素活性的拮抗作用。(3)采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)及免疫印迹方法（Western Blotting）方法，检测雌激素受体α（estrogen receptorα，ERα）、雌激素受体β（estrogen receptorβ，ERβ）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R)、胆固醇侧链裂解酶（cytochrome P450，family11，subfamily A,polypeptide1，CYP11A1）、芳香化酶（cytochrome P450，family19，subfamily A，polypeptide1，CYP19A1）基因及蛋白表达水平。结果采用单因素方差分析。通过染毒组、治疗组及对照组的相互对比，阐明中药拮抗EEDs拟雌激素活性的作用机制。
　　结果:(1)确定爪哇猴由EEDs引致性早熟疾病模型，应以26月龄为最佳月龄，以低剂量BPA（200mg/kg）及4-NP(50mg/kg)为最佳染毒剂量，以4周为最佳染毒时间。(2)染毒组与对照组比较雌激素水平明显升高，阴道脱落细胞成熟指数显著增加，子宫湿重、脏器系数、子宫内膜上皮细胞高度、子宫腺上皮高度显著增加，子宫内膜及肌层厚度明显增高。治疗组与染毒组相比，上述指标均显著降低(p＜0.05)。(3) RT-PCR方法检测显示BPA、4-NP联合染毒可导致ERα、ERβ、EGFR、IGF-1R、CYP11A1、CYP19A1的mRNA表达水平显著上调(p＜0.05)。而中药干预后，可使上述基因表达显著下调(p＜0.05)。(4)经Western Blot方法验证BPA、4-NP联合染毒可导致ERα、ERβ、EGFR、CYP19A1的蛋白表达水平显著上调(p＜0.05)。而中药干预后，可使上述蛋白表达显著下调(p＜0.05)。
　　结论:(1)我们成功地建立了灵长类——爪哇猴由EEDs引致的性早熟疾病模型;(2)在爪哇猴性早熟模型上验证了滋阴泻火中药对EEDs的拟雌激素活性具有显著的拮抗作用;(3)滋阴泻火中药可通过使生殖器官ER、EGFR、IGFR表达的下调以及雌激素合成关键酶的表达下调，多水平、多靶点地发挥其对EEDs拟雌激素活性及生殖毒性的拮抗作用。

目录

主要缩略词表

摘要

前言

技术路线

第一部分 建立爪哇猴由环境内分泌干扰物引致性早熟疾病模型的预实验

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

小结

第二部分 中药对环境内分泌干扰物拟雌激素活性的拮抗作用

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

小结

第三部分 中药拮抗EEDs拟雌激素活性的作用机制研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

小结

结论

创新点

参考文献

环境内分泌干扰物与儿童性早熟发病的关系

致谢

声明