自然杀伤细胞及其免疫调节机制对隐球菌感染影响及相关机制研究

摘要

第一部分自然杀伤细胞在隐球菌感染中的变化及其对隐球菌摩染病程的影响
　　 一、小鼠肺隐球菌感染模型以及NK细胞耗竭(NK cell depleted mice model)小鼠模型的建立
　　 目的：建立小鼠肺隐球菌感染模型以及NK细胞耗竭小鼠模型
　　 方法：C57BL/6小鼠经腹腔注射2.5％Avertin麻醉后，于小鼠一侧鼻孔内缓慢滴入已调整浓度的菌液(接种量1×106/小鼠)。对照组小鼠经小鼠一侧鼻孔缓慢滴入无菌PBS，观察小鼠肺部病变、病理变化、脏器真菌载量。同时，C57BL/6小鼠予以腹腔注射anti-NK1.1单抗腹水(150μL/小鼠)，观察小鼠脾细胞中NK细胞的变化。
　　 结果：经鼻腔滴入隐球菌液后，小鼠肺部可见肉眼病灶，肺病理切片中可观察到酵母菌，肺组织匀浆培养可见隐球菌菌落形成。小鼠经anti-NK1.1单抗腹水处理后2天，脾细胞中NK细胞的比例明显下降(>90％)，效果可持续10天以上。
　　 结论：通过经鼻滴入隐球菌液建立了小鼠肺隐球菌感染模型，经腹腔注射anti-NK1.1单抗建立NK细胞耗竭小鼠模型。
　　 二、隐球菌感染时体内自然杀伤细胞数量和功能变化的时相特征以及对于隐球菌感染病程的影响
　　 目的：系统探讨隐球菌感染后感染灶局部和全身NK细胞数量和功能变化的时相特征，以及对于主要脏器的真菌载量和小鼠生存率的影响
　　 方法：使用小鼠肺隐球菌感染模型和NK细胞耗竭小鼠模型，将小鼠分为anti-NK1.1未处理和处理组，观察感染后第1、3、7、14天小鼠肺部及脾脏内NK细胞数量、活化状态、脱颗粒情况，观察感染后第1、3、7、10、14天小鼠肺部和脑部真菌载量变化，观察小鼠生存曲线的变化。
　　 结果：隐球菌感染后小鼠脾细胞总数、脾细胞中NK细胞数量、肺间质白细胞总数、肺间质白细胞中NK细胞数量均明显增加，而小鼠体内NK细胞耗竭对于脾细胞总数无明显影响，但可显著影响感染第7天时肺间质白细胞总数(P<0.05)。小鼠隐球菌感染后，NK细胞表面CD69表达、CD107a的表达、胞内IFNγ的分泌、胞内perforin的表达在感染早期即明显增加，以感染后第3天时最为明显，随后即逐渐下降。Anti-NK1.1未处理组小鼠隐球菌感染后肺部真菌载量在感染早期逐渐增加，感染后10天至14天最为明显，其后有逐渐下降趋势，而anti-NK1.1处理小鼠则随感染时间延长而逐渐增加，两组小鼠在感染第3天、第14天、第28天有显著差异(P<0.05)。隐球菌感染小鼠在感染后7天左右脑部匀浆真菌培养阳性，但两组小鼠间无显著差异(P>0.05)。与anti-NK1.1未处理组小鼠相比，anti-NK1.1处理组的小鼠死亡出现更早且死亡比例更高，两组间差异具有统计学意义(P=0.0007)。
　　 结论：隐球菌感染时，感染小鼠肺部和全身NK细胞数量明显增加，NK细胞耗竭可影响肺部间质白细胞总数。小鼠肺部隐球菌感染后，小鼠NK细胞均可被活化，NK细胞脱颗粒能力增强，且在感染后第3天时最为明显。小鼠体内NK细胞耗竭后可显著增加感染早期和后期肺部真菌载量，但对脑部真菌载量无影响。体内NK细胞耗竭后可显著影响隐球菌感染小鼠的生存曲线。
　　 一、自然杀伤细胞在隐球菌感染时对适应性免疫的影响
　　 目的：研究小鼠隐球菌感染时NK细胞对机体适应性免疫反应的影响。
　　 方法：使用小鼠肺隐球菌感染模型和NK细胞耗竭小鼠模型，将小鼠分为anti-NK1.1未处理和处理组，检测小鼠感染后第7天、第14天时肺间质白细胞中CD4+T细胞内IFNγ、IL-4分泌情况，测定小鼠感染后第7天、第14天时肺组织匀浆中IFNy、IL-4的水平。
　　 结果：小鼠肺隐球菌感染后第7天和第14天，肺间质白细胞中CD4+T细胞胞内IFNv分泌均显著增加(P<0.05)，呈逐渐上升趋势。而肺间质白细胞中CD4+T细胞胞内IL-4分泌于感染后第7天最显著，至感染后第14天则较第7天有所下降。当体内NK细胞耗竭后，小鼠肺间质白细胞中CD4+T胞IFNγ分泌较未处理小鼠显著减少，而且在感染第14天时较感染后第7天时无明显增加，小鼠肺间质白细胞中CD4+T细胞IL-4分泌则逐渐增加。小鼠肺隐球菌感染后第7天和第14天，肺组织匀浆中IFNv水平均显著增加，呈逐渐上升趋势，而NK细胞体内耗竭后，增加程度显著下降(P<0.05)。小鼠肺隐球菌感染后第7天和第14天，肺组织匀浆中IL-4水平均显著增加(P<0.05)，以感染后第7天最为明显(P<0.05)，感染后第14天较感染后第7天显著下降(P<0.05)。当体内NK细胞耗竭后，肺组织匀浆中IL-4水平显著增加，且感染后第14天较感染后第7天升高。
　　 结论：隐球菌感染后，机体诱导形成的Th1免疫反应逐渐增强，Th2免疫反应在感染后第7天则逐渐减弱。当体内NK细胞耗竭后，机体诱导形成的Th1免疫反应虽逐渐增强，但程度明显减弱，而Th2免疫反应则明显增强，从而影响机体的Th1/Th2平衡。
　　 二、自然杀伤细胞在隐球菌感染时对树突状细胞的影响
　　 目的：研究隐球菌感染时DC的成熟状态和功能，探讨NK细胞对于上述变化的影响。
　　 方法：利用小鼠骨髓细胞诱导的DC(BMDC)与热灭活隐球菌共孵育，观察BMDC的共刺激因子表达，检测培养上清中IL-12p40和TNFα水平。使用小鼠肺隐球菌感染模型和NK细胞耗竭小鼠模型，将小鼠分为anti-NK1.1未处理和处理组，体内观察感染第7天时DC的表面共刺激因子的表达，检测肺间质白细胞中DC比例、数量、类型的变化，观察，细胞的变化，测定肺组织匀浆中IL-12p40的水平，以及NK细胞体内耗竭对上述变化的影响。
　　 结果：BMDC与热灭活隐球菌共孵育后，BMDC表面MHCⅡ、CD80、CD86表达均显著增加，其培养上清也中IL-12p40和TNFα水平也显著升高(P<0.05)。小鼠感染后第7天时，DC表面MHCⅡ、CD80、CD86表达均增加，以MHCⅡ最为显著，当体内NK细胞耗竭后，MHCⅡ和CD86表达但较未处理的感染小鼠显著下降，而CD80感染后表达无明显增加。小鼠感染后第7天时，肺间质白细胞中DC的比例和绝对数量、CD45+CD11b+Gr-lint细胞的比例均明显增加(P<0.05)，当体内NK细胞耗竭后，虽然DC比例和绝对数量以及CD45+CD11b+Gr-lint细胞仍高于未感染小鼠，但显著低于未处理小鼠(P<0.05)。小鼠隐球菌感染后，肺间质白细胞中DC的类型均以mDC为主，两组间无明显差异(P>0.05)。小鼠肺隐球菌感染后第7天，肺组织匀浆中IL-12p40水平显著上升，但体内NK细胞耗竭时IL-12p40水平可显著降低(P<0.05)。
　　 结论：隐球菌感染后增加感染灶中DC的比例和数量，诱导DC的成熟，增加细胞因子分泌，促进机体Th1免疫反应形成。隐球菌感染后感染灶中DC以mDC为主。隐球菌感染时，感染灶中DC前体细胞增加，可使感染灶中DC数量增加。体内NK细胞耗竭后，DC感染灶中DC前体细胞比例、DC的比例和数量、DC的成熟状态机细胞因子的分泌均受到影响，由此可能影响Th1免疫反应的形成，但DC的类型无明显改变。