以丝素蛋白颗粒行声带注射填充喉成形术的初步实验研究

摘要

第一章丝素蛋白颗粒的制备及其生物相容性的初步研究
　　 目的：制备不同粒径范围的丝素蛋白(Silk Fibroin，SF)颗粒，并通过体外、体内实验对其生物相容性进行初步研究。
　　 方法：再生丝素蛋白经过机械粉碎及筛网筛分，得到适于声带注射填充的不同粒径范围的SF颗粒，通过扫描电镜观察其形状、大小和表面特性；体外实验中，将两种不同粒径范围的SF颗粒与RAW264.7巨噬细胞共同培养24h后，通过倒置显微镜观察细胞形态的变化，real time RT-PCR及ELISA检测IL-1β、IL-6和TNF-α三种促炎因子的表达和分泌来评估炎症反应的程度；体内实验利用BALB/c小鼠气囊动物模型及新西兰大白兔为实验对象，通过对SF颗粒囊内注射后BALB/c小鼠气囊内促炎因子的释放及囊壁组织病理变化的急性期观察，以及对新西兰大白兔背部肌肉内注射SF颗粒后，局部组织病理学变化的长期观察，评估SF颗粒在体内炎症反应的过程及转归。
　　 结果：再生丝素蛋白经机械粉碎及筛网筛分，得到粒径范围分别为10-45μm(SFS)及45-125μm(SFL)的两种SF颗粒，扫描电镜观察发现，颗粒形态不规则，表面略粗糙；SFS和SFL与RAW264.7巨噬细胞共培养24h，能够引起巨噬细胞TNF-α mRNA表达的显著上调，其中SFS引起的TNF-α mRNA上调更为明显，但是ELISA检测显示两种SF颗粒均不会引起任何促炎因子分泌的增加；皮下气囊动物模型的动物实验发现，SFL及SFS刺激48小时，均能引起囊腔灌洗液中IL-1β、IL-6和TNF-α分泌的显著增加，但除了TNF-α以外均低于阳性对照组，同时两种粒径范围的SF颗粒均能引起与阳性对照组类似的囊壁组织的增生增厚及类似的炎症细胞浸润，各检测指标SFS刺激组均高于SFL刺激组；SFL及SFS新西兰大白兔背部肌肉内注射均能引起较为明显的急性期炎症反应，但随着时间的延长，炎症反应逐渐减轻，伴有有限的纤维结缔组织的增生，两种粒径范围的SF颗粒最终为薄层胶原纤维包裹固定，SFL与SFS刺激所引起局部炎症反应及纤维化程度组间差异不显著，SF颗粒材料在体内观察6个月无明显降解。
　　 结论：体外实验表明，SF颗粒具有良好的生物相容性，但提示有可能会导致TNF-α介导的炎症反应；体内实验发现，SF颗粒会导致较为明显的急性期炎症反应，IL-1β、IL-6和TNF-α三种促炎因子均参与，以TNF-α为主，随着时间的延长，炎症反应逐渐减轻，SF颗粒表现出良好的生物相容性及不易游走移位的特点，其中SFS引起的早期炎症反应较SFL明显；SFL有可能成为一种良好的声带注射填充材料。
　　 第二章丝素蛋白颗粒行声带注射填充喉成形术的初步动物实验研究
　　 目的：通过动物实验来评估以丝素蛋白颗粒行声带注射填充喉成形术的可行性及其效果。
　　 方法：以新西兰大白兔和比格犬为实验对象，首先切断并结扎迷走神经(新西兰大白兔)或者喉返神经(比格犬)制作左侧声带麻痹的动物模型，即刻以SFL(与HA(Hyalunic Acid，医用透明质酸钠)等体积混合)经甲状软骨板穿刺行左侧声门旁间隙及声带肌内注射填充喉成形术。术后定期处死实验动物，对兔喉进行组织病理学观察；对比格犬离体喉行吹鸣喉实验进行嗓音的空气动力学评估，并通过高速摄影观察声带黏膜波动。
　　 结果：以SFL行新西兰大白兔单侧声带麻痹动物模型声带注射填充喉成形术的动物实验研究发现，SFL在麻痹侧声带内注射所引起的组织病理变化与背部肌肉内注射类似，SFL在声门旁间隙及声带肌内注射所引起的炎症反应局限，轻微，未见化脓、坏死、肉芽肿以及材料游走移位，SFL不易降解吸收，声带黏膜上皮层及黏膜下层的组织病理结构正常，不受影响；以SFL行比格犬单侧声带麻痹动物模型声带注射填充喉成形术的动物实验研究发现，SFL声带内注射会引起离体喉嗓音空气动力学参数及声带黏膜波动的显著变化，早期表现为PTP(Phonation Threshold Potential，阈发音声门下压)、PTF(Phonation Threshold Flow，阈发音气流)及PTW(Phonation Threshold Power，阈发音功率)的下降和声带黏膜波动振幅的减弱，说明SFL声带内注射后声门面积的减小及发音效率的提高，但同时可能会影响声带黏膜波动；随着时间的延长，术后6个月时，PTP、PTF及PTW均有所升高，声带黏膜波动有所增强然而仍弱于对照组，实验结果表明注射材料由于HA的吸收体积变小而致声门闭合程度下降，并且由于材料周围的纤维结缔组织增生引起声带张力的增加及黏弹性能的下降会影响到声带的黏膜波动。
　　 结论：SFL作为一种声带注射填充材料，具有良好的生物相容性和位置稳定性，不易被降解吸收，可改善单侧声带麻痹动物模型的嗓音空气动力学参数，但可能会导致黏膜波动振幅减弱。将来应注意避免材料中HA的吸收而导致的填充效果的下降，同时应当改善SFL材料的粘弹特性以和声带组织匹配来减少注射材料对声带黏膜波动的影响。