肝脏非实质细胞照射对残存肝肿瘤细胞及肝实质细胞放射敏感性的影响

摘要

第一部分
　　 肝脏非实质细胞的分离培养及细胞因子芯片检测
　　 目的：肝脏非实质细胞经辐射后可释放多种小分子物质，对肝实质细胞放射敏感性及照射后残存肝癌细胞产生影响。分离培养肝非实质细胞，为后续实验研究打下基础。
　　 方法：通过灌洗，消化SD大鼠肝脏，采用密度梯度方法离心分离获得肝非实质细胞，分离到非实质细胞培养后行照射，分别提取上清液(SR和SnonR)，行细胞因子芯片检测。
　　 结果：成功分离得到肝脏非实质细胞，分离所得的非实质细胞不表达肝实质细胞所表达的白蛋白，上清液细胞因子芯片结果分析显示：照射后多种炎症相关因子及与转移相关的因子升高。
　　 结论：辐射可以诱导肝脏非实质细胞释放多种细胞因子，可能对肝实质细胞和照射后残存肿瘤细胞产生影响。
　　 第二部分肝脏非实质细胞放疗后上清液对肝癌照射存活后代细胞侵袭转移潜能的影响
　　 目的：观察肝非实质细胞经辐射后培养上清液是否对肝癌照射的残存后代细胞的侵袭转移能力发生影响，并探讨这一作用的可能机制。
　　 材料与方法：大鼠肝非实质细胞原代分离培养后，随机分为照射组及非照射组。照射组细胞经X线一次性照射10Gy。48小时后提取照射组培养上清液(SR)及非照射组上清液(SnonR)加入McA-RH7777肝癌细胞，肝癌细胞也经X线一次性照射10 Gy后反复传代8代后，观察它们的侵袭转移能力变化(RH10Gy-SR，RH10Gy-SnonR以及McA-RH7777)。三组细胞分别采用体外transwell小室铺基质胶的侵袭实验及Buffalo大鼠原位种植后观察肺转移结节，来检测它们的转移能力。
　　 结果：体外实验观察，三组细胞侵袭能力RH10Gy-SR>RH10Gy-SnonR>McA-RH7777。三组种入小室的细胞经24小时培养后取出计数，200倍视野下穿出数目分别为40±4.74个，30.6±3.85个和11.4±3.56个。Buffalo大鼠原位种植4周后观察肺转移结节数分别为28.83±5.38，22.17±4.26，8.3±3.8个。ELISA检测到与转移相关的多个因子照射组培养上清液较未照射组上清液增高。
　　 结论:辐射诱导增强了肝癌残存后代肿瘤细胞转移侵袭能力的提高，并且辐射刺激肝非实质细胞释放的物质促使癌细胞侵袭转移能力进一步增强。照射后与肿瘤转移相关的细胞因子增高可能是促进侵袭转移能力增强的重要因素。
　　 第三部分肝脏非实质细胞放疗后上清液增高肝实质细胞放射敏感性及其机制研究
　　 目的：肝细胞在体外培养对辐射耐受，而肝脏是辐射敏感器官。本研究观察肝非实质细胞体外培养后经照射的培养上清液是否影响肝细胞的放射敏感性，并对其机制作进一步探索。
　　 方法：
　　 1.集落形成法检测SR及SnonR对BRL3A放射敏感性的影响：SR及SnonR分别加入大鼠肝细胞系BRL3A，BRL3A细胞随后也经X线一次性照射10Gy(BRL/SR组、BRL/SnonR组)，后采用Annexin V-PI双染流式细胞仪及JC-1法检测细胞凋亡情况。
　　 2.采用SiRNA技术沉默BRL3A细胞的促凋亡蛋白Bid，细胞分为二组，沉默组(Si组)及阴性对照(NC组)。后续实验分为四组：(1)NC/SR组；(2)NC/SnonR组；(3)Si/SR组；(4)Si/SnonR组。四组细胞照射10Gy后12小时分别进行细胞核荧光染色检测各组细胞凋亡情况。
　　 3.免疫印迹法检测上述四组细胞照射10 Gy后6小时，12小时，24小时凋亡相关蛋白tBid，caspase9和caspase3的表达情况。
　　 结果：
　　 1.克隆形成实验显示在照射6，8，10Gy时，BRL/SnonR组集落形成数高于BRL/SR组，分别为0.170±0.122 vs0.085±0.112；0.103±0.006 vs0.059±0.007:0.0516±0.005 vs0.027±0.006，(P<0.01)。而在1，2，4 Gy时，集落形成数无差异。BRL/SR组、BRL/SnonR组照射24小时后采用流式细胞检测显示，加SR组正常细胞数较SnonR组明显减少(0.561±0.091 vs0.743±0.078，P=0.02)；JC-1法显示SR组凋亡细胞数比例较SnonR明显高(0.554±0.108 vs0.388±0.082，P=0.025)。2.SiRNA法明显降低了BRL3A细胞Bid蛋白的表达。NC组/SR、NC组/SnonR、Si组/SR、Si组/SnonR细胞核荧光染色检测细胞坏死凋亡比例分别为0.164±0.015，0.113±0.033，0.058±0.014，0.045±0.019。NC/SR组、NC/SnonR组比较有统计学差异(P=0.015)。在Si/SR组、Si/SnonR组细胞比较，两组无明显差异(P=0.256)。Si组细胞凋亡率明显低于NC组(P值均小于0.01)。
　　 3.免疫印迹法检测显示在NC组，加入SR组在12，24小时，tBid，激活的caspase-9，激活的caspase-3表达高于SnonR组。而在Si组蛋白加入SR组与加SnonR组无区别。
　　 结论:肝非实质细胞原代分离培养后，辐射诱导NPC释放了TNF-α等因子。肝非实质细胞体外培养后照射的培养上清液增高了肝细胞BRL3A的放射敏感性，这一作用与肿瘤坏死因子受体凋亡信号通路活化有关。通过沉默Bid蛋白，可明显提高BRL3A的辐射耐受性。