血浆microRNA作为肝癌及慢性乙肝肝损伤分子标记物的研究

摘要

世界范围内，乙肝病毒(HBV)感染人群超过了4亿。其中1/3的感染发生在中国。持续的HBV可造成肝功能失调，肝硬化甚至肝癌。在我国，由于乙肝病毒感染率居高不下导致肝癌的发病率非常高，“乙肝-肝硬化-肝癌”被称为肝癌三部曲。
　　 肝细胞肝癌(HCC，以下简称肝癌)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，多发于东南亚及非洲，病毒性肝炎及黄曲霉毒素是目前己明确的致癌高危因子。在我国，肝癌是第二位肿瘤杀手，全世界每年的新发病例55％来自中国。现代医学对肝癌进行科学研究一百多年，虽然取得了不少成绩，但肝癌人群的总体5年生存率至今仍只有7％左右。在我国，大多数患者确诊时已经进入肝癌晚期，从而失去治疗机会。及时准确的诊断是降低死亡率的有效途径。甲胎蛋白(AFP)是目前最常用的肝癌标记物，但是在生殖细胞肿瘤，胃肠道肿瘤及肝硬化患者中也能观察到AFP升高。另外，仅有70％的肝癌患者AFP升高。30％的患者缺乏有效的诊断分子标记物。因此寻找新的肝癌诊断生物标记物成为目前研究的热点及难点。
　　 乙肝感染导致的慢性肝损伤是肝硬化和肝癌的罪魁祸首。有效地监测慢性乙肝(CHB)患者肝损伤的程度并及时的干预对于治疗肝脏纤维化、肝硬化以及肝癌至关重要。目前肝穿刺活检是评估CHB肝损伤的金标准。肝穿刺病理形态学检查可以直观地评估肝脏炎症、肝细胞损伤和纤维化程度。然而，有创的穿刺活检可能导致大出血等严重并发症，患者常常难以接受。另外，穿刺的部位选择可能影响检查的结果。谷丙转氨酶(ALT)是目前临床上常用的肝脏损伤血清学指标，由于其与肝损伤的组织学形态改变相关性不好，其特异性和敏感性常常受到质疑。因此，寻找可以反应组织学形态的变化，并且灵敏度和特异性比ALT更好的指标，也是目前研究的一个热点。
　　 近十多年以来microRNA的研究成为分子生物学的一个热点。microRNA是一类进化保守的内源性表达的小RNA，为20-25个核苷酸(nt)，它广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，其本身不具有开放阅读框。成熟的microRNA，5’端有一个磷酸基团，3’端为羟基。microRNA可以调控靶mRNA的表达。在1993年被发现以来就被认为在细胞发育、分化、增殖和凋亡中有重要功能。microRNA的表达具有时间和空间特异性，在癌症领域的研究已经发现，microRNA在不同的癌症组织中具有相对特异性的表达谱，提示microRNA可能会成为诊断疾病的新的分子标记物。同时，由于microRNA的特殊结构，可以抵御RNA酶的降解，在血浆或血清中的microRNA能够稳定地存在。因此研究认为，外周血microRNA有可能成为理想的新型疾病分子标记物。高通量的microRNA检测技术如microRNA芯片、基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法为全基因组范围的microRNA谱分析提供了有力的技术支持。
　　 本课题利用高通量microRNA芯片检测，发现了血浆microRNA在肝癌患者的特异性表达谱。通过qRT-PCR的验证，找到关键的microRNA。通过统计学的分析和独立样本中的验证，建立了诊断HCC的诊断模型，以期可以帮助HCC的诊断，提高诊断准确性，降低漏诊率，使得HCC患者可以早发现早治疗，提高五年生存率。同时，在研究过程中，发现在CHB肝损伤患者中表达异常的microRNA。利用相同的检测方法，在第二部分研究中，增加了CHB血浆样本量并收集了CHB肝穿刺标本，进行研究。发现microRNA与肝组织损伤的相关性。以期为慢性肝损伤的研究提供新思路。
　　 第一部分血浆microRNA作为乙肝相关性肝癌早期诊断标记物的研究
　　 目的：通过microRNA芯片筛选和qRT-PCR验证肝癌血浆microRNA，并研究其作为血浆标记物，诊断肝癌的准确性。
　　 方法：首先用microRNA芯片筛选肝癌患者和三组对照样本(健康组、慢性乙肝患者、肝硬化患者)血浆microRNA的表达谱。通过Gene Spring软件和聚类分析筛选肝癌差异表达的血浆microRNA。芯片筛选出的肝癌差异microRNA进一步用qRT-PCR在407例训练集检测其表达。基于训练集的检测结果，构建了肝癌诊断的Logistic回归模型，ROC分析被用来评估其诊断效能。验证集被用来进一步证实该模型。
　　 结果：发现了一组血浆microRNA(miR-122，miR-192，miR-21，miR-223，miR-26a，miR-27a and miR-801)。构建了这些血浆microRNA表达值组成的回归模型，可以准确地区分肝癌样本和对照样本(训练集AUC=0.864，验证集AUC=0.888)。该模型的诊断准确性不会受到肝癌分期的影响(BCLC0期，A期，B期，C期的AUC分别为0.888，0.888，0.901，0.881)。该模型也能将肝癌患者从健康人(AUC=0.941)、慢性乙肝患者(AUC=0.842)、乙肝肝硬化患者(AUC=0.884)中区分开来。
　　 结论：该血浆microRNA模型可以用于帮助诊断肝癌患者，对从而使一大批以前因为缺乏诊断而失去根治性治疗的患者得到及时的治疗。
　　 第二部分慢性乙肝患者血浆microRNA与肝脏组织病理形态学相关性的研究
　　 目的：寻找慢性乙肝肝损伤患者表达差异的血浆microRNA并进一步研究其与组织病理学的相关性及作为监测肝损伤分子标记的可行性。
　　 方法：首先我们用芯片检测22例CHB患者和33例健康人血浆microRNA的表达谱。通过Gene Spring软件和聚类分析筛选在CHB患者血浆中表达升高的microRNA。进一步用qRT-PCR在118例CHB患者和58例健康人中验证其表达值。验证后的血浆差异表达microRNA在66例患者对应的肝穿刺组织检测其表达，用来评估血浆microRNA和组织microRNA表达的相关性。并分析其作为诊断CHB肝损伤的标记物的可行性。
　　 结果：miR-122，miR-148a，miR-192，miR-194，miR-215，miR-27b在血浆中的表达随着炎症活动程度和纤维化程度的增加，均呈现下降的趋势，并且在组织中的表达有相似的变化。与无肝细胞坏死的组相比，有肝细胞坏死组中6个microRNA的表达明显下降，同样与无纤维化组比较，在有纤维化组下降显著(p<0.01)。建立由miR-122，miR-148a，miR-194，miR-27b组成的诊断模型，区分CHB病人与正常人对照，AUC=0.938；由miR-148a和miR-194组成的诊断模型，诊断CHB病人中有无肝细胞坏死，AUC=0.857，miR-122诊断CHB病人中有无肝纤维化，AUC=0.800。
　　 结论：慢性乙肝患者血浆microRNA的变化与肝损伤形态改变有密切的联系，可能成为潜在的肝损伤分子标记物，对早期肝损伤的诊断提供帮助。